Transcript קרפ 6 דומע 1

‫פרק ‪6‬‬
‫פרק ‪6‬‬
‫עמוד ‪1‬‬
‫סדר העניינים‪...‬‬
‫‪ ‬חלק ראשון‪ :‬מבוא ‪ -‬תאור התהליך‪ ,‬סוגי כרומטוגרפיה‪...‬‬
‫‪ ‬חלק שני‪ :‬תאור כמותי ‪,‬גימלון‬
‫פרק ‪6‬‬
‫עמוד ‪2‬‬
‫חלק ראשון‪ :‬מבוא‬
‫מטרות‬
‫‪ ‬תאור תהליך כרומטוגרפיה בעמוד‬
‫‪ ‬תופעת העיכוב‬
‫‪ ‬תאור כללי של סוגי כרומטוגרפיה‬
‫וחומרי מילוי‬
‫‪ ‬ניתוח כרומטוגרמות‬
‫פרק ‪6‬‬
‫עמוד ‪3‬‬
‫תהליך כרומטוגרפיה בעמוד‬
‫‪Column Chromatography‬‬
‫מריץ‬
‫(אלואנט)‬
‫פאזה נייחת‬
‫‪Stationary Phase‬‬
‫פרק ‪6‬‬
‫עמוד ‪4‬‬
‫עיכוב‬
‫פרק ‪6‬‬
‫עמוד ‪5‬‬
‫מה גורם להבדלים בעיכוב בין חומרים שונים?‬
‫המפתח לתכנון כרומטוגרפיה יעילה‬
‫הבדלי גודל‬
‫אינטראקציות‬
‫הידרופוביות‬
‫עם הפאזה‬
‫ביולוגיות ‪ -‬ספציפיות‬
‫הנייחת‬
‫כימיות ‪ -‬לא ספציפיות‬
‫אלקטרוסטטיות‬
‫שוני בתכונות הפיזיקליות‪,‬‬
‫הכימיות ו‪/‬או הביולוגיות בין‬
‫מרכיבי תערובת החומרים‬
‫במרק‬
‫ואן‪-‬דר‪-‬ואלס‬
‫תכונות הפאזה הנייחת‬
‫פרק ‪6‬‬
‫עמוד ‪6‬‬
‫ניתוח כרומטוגרמות‬
‫תאור בעזרת פילוג גאוסיאני‬
‫ ‪s‬קריאת הגלאי‬‫ ‪t‬זמן הרצה‬‫‪Signal‬‬
‫‪Signal‬‬
‫ ‪V‬נפח שנאסף‬‫ ‪smax, tmax, Vmax‬נפח‪ ,‬זמן‪ ,‬קריאת‬‫גלאי בנקודת המקסימום‬
‫‪tmax -‬סטיית תקן‬
‫‪ V Vmax  12 ‬‬
‫‪exp ‬‬
‫‪‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫פרק ‪6‬‬
‫‪Time‬‬
‫)‪Time (Volume‬‬
‫)‪(Volume‬‬
‫‪s  s max‬‬
‫‪ t t max  12 ‬‬
‫‪exp ‬‬
‫‪‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪s  s max‬‬
‫)‪(6.1‬‬
‫עמוד ‪7‬‬
‫השבה של מומס‬
t:‫כמות מומס שיצאה עד זמן‬
  t t max  1 2 
 dt 
0 Qydt  Qs max 0 exp  2 2


t
t



 t max Qs 2max 1  erf t t max  1
2
2

x
2 u 2
erf x  
e du

 0
  t t max  1 2 
 dt 
0 Qydt  Qs max 0 exp  2 2



(6.2)
8 ‫עמוד‬



R e  12 1  erf t t max 1
2

1
 t max Qs 2max
2
:‫סה”כ מומס בעמוד‬
Re ‫השבה‬
6 ‫פרק‬
‫כושר הפרדה ודרגת טיהור‬
2t max, 2 *  2  t max, 1 * 1 
Rs‫ רזולוציה‬- ‫כושר הפרדה‬
Signal
(6.3) R s 
t max, 2  t max, 1
Rs>1.6‫שיאים מופרדים‬
Time (Volume)
4t max ‫רוחב השיא‬
(6.4)
Pu ,i 
s max, i R e,i
 s max, j R e, j
Pu‫דרגת טיהור‬
j
9 ‫עמוד‬
6 ‫פרק‬
‫סוגי תהליכי כרומטוגרפיה‬
‫סוג‬
‫כרומטוגרפיה‬
‫ג’ל פילטרציה ‪Gel Filtration‬‬
‫‪Gel Permeation Chromatography, GPC‬‬
‫‪Size Exclusion Chromatography, SEC‬‬
‫גודל‬
‫המולקולה‬
‫חלבונים‪ ,‬סילוק‬
‫יונים‬
‫כרומטוגרפיה הידרופובית‬
‫אינטראקציות‬
‫הידרופוביות‬
‫ויטמינים‪,‬‬
‫חלבונים‪,‬‬
‫אנטיביוטיקה‬
‫אינטראקציות‬
‫הידרופוביות‬
‫ויטמינים‪,‬פפטידים‬
‫חלבונים‪,‬‬
‫אנטיביוטיקה‬
‫‪Hydrophobic Interaction‬‬
‫‪Chromatography, HIC‬‬
‫פאזה הפוכה‬
‫‪Reveres Phase‬‬
‫‪Chromatography, RPC‬‬
‫פרק ‪6‬‬
‫שינויים בעיכוב‬
‫נובעים מהבדלי‪...‬‬
‫ישומים‬
‫עמוד ‪10‬‬
‫סוגי תהליכי‬
‫סוג‬
‫כרומטוגרפיה‬
‫ספיחה‬
‫‪Adsorption Chromatography‬‬
‫שינויים בעיכוב‬
‫נובעים מהבדלי‪...‬‬
‫אינטראקציות‬
‫לא‪-‬ספציפיות‬
‫ישומים‬
‫חלבונים ‪, DNA,‬‬
‫‪RNA‬‬
‫אינטראקציות‬
‫חשמליות‬
‫חלבונים‪ ,‬חומצות‬
‫אורגניות‬
‫‪Affinity Chromatography‬‬
‫אינטראקציות‬
‫ספציפיות (ביולוגיות)‬
‫פפטידים‪ ,‬חלבונים‬
‫‪Perfusion Chromatography‬‬
‫אינטראקציות שונות‬
‫חילוף יונים‬
‫‪Ion Exchange‬‬
‫‪Chromatography, IEC‬‬
‫כרומטוגרפית זיקה‬
‫פרק ‪6‬‬
‫כרומטוגרפיה( המשך)‬
‫חלבונים‬
‫עמוד ‪11‬‬
‫חומרי מילוי‬
Packing Materials
(GPC)‫ג’ל‬
12 ‫עמוד‬
‫חלקיק נקבובי‬
Perfusion
Chromatography
6 ‫פרק‬
‫ פילטרציה‬- ‫ג’ל‬
‫ הבדלי גודל‬:‫עיכוב‬
Gel Filtration ‫ג’ל פילטרציה‬
Gel Permeation Chromatography, GPC
Size Exclusion Chromatography, SEC
‫• נפוץ לקביעת משקל מולקולרי‬
‫• שימוש בדוגמאות כיול‬
V
 a * ln MW   b :‫• מתאם שכיח‬
V0
Bio-Gel (Polyacrylamid)
Sephadex (Dextran)
Agarose
13 ‫עמוד‬
Styragel (Polystyren)
6 ‫פרק‬
‫כרומטוגרפיה הידרופובית‬
‫פאזה הפוכה‬
‫עיכוב‪ :‬אינטראקציות הידרופוביות‬
‫ביו‪-‬פולימרים וביוכימיקלים הידרופוביים‬
‫כרומטוגרפיה הידרופובית‬
‫‪Hydrophobic Interaction‬‬
‫‪Chromatography, HIC‬‬
‫כרומטוגרפית פאזה הפוכה‬
‫‪Reveres Phase‬‬
‫‪Chromatography, RPC‬‬
‫פרק ‪6‬‬
‫• אינטראקציות חלשות‬
‫• קבוצות ‪ butyl‬או ‪ phenyl‬קשורות למצע נייח‬
‫• אלואנט מימי‪ ,‬ריכוז מלח גבוה‬
‫• אינטראקציות חזקות‬
‫• ‪ alkanes‬קשורים למצע נייח (‪ 8-18‬פחמנים)‬
‫• אלואנט אורגני‬
‫עמוד ‪14‬‬
‫חילוף יונים‬
‫‪Ion-Exchange Chromatography‬‬
‫עיכוב‪ :‬אינטראקציות חשמליות‬
‫חלבונים‪ ,‬חומצות אמינו‪ ,‬חומצות אורגניות‬
‫חילוף (הפיך) של יונים נגדיים ביונים‬
‫בעלי סימן זהה מהפאזה הניידת‬
‫‪A   B Re s  B  A Re s‬‬
‫יונים נגדיים‬
‫‪Counter ions‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫מחליף‬
‫קטיונים‬
‫יונים קשורים‬
‫‪Fixed ions‬‬
‫פרק ‪6‬‬
‫עמוד ‪15‬‬
‫צעד נוסף לשיפור ההפרדה‪...‬‬
‫‪ ‬שינויי בהרכב הממס)‪(Gradient methods‬‬
‫מחלף יונים ‪ -‬הגדלה הדרגתית של ריכוז מלח‬
‫כרומטוגרפיות הידרופוביות ‪ -‬שינוי ריכוזי הממיסים באלואנט‬
‫‪‬‬
‫הזרקת תוספים)‪(Displacement chromatography‬‬
‫‪dextran sulfate‬‬
‫‪carboxymethyl strach‬‬
‫)‪imminodiacetic acid (IDA‬‬
‫פרק ‪5‬‬
‫עמוד ‪16‬‬
‫זרימה רדיאלית כרומטוגרפית‬
‫‪Radial flow chromatography‬‬
‫מריץ‬
‫(אלואנט)‬
‫פרק ‪5‬‬
‫עמוד ‪17‬‬
‫זרימה רדיאלית‬
‫יתרונות‬
‫• הקטנת מפל לחץ‬
‫• זרימה אחידה בעמוד‬
‫• רגישות נמוכה‬
‫לזיהומים מוצקים‬
‫פרק ‪5‬‬
‫עמוד ‪18‬‬
‫זרימה רדיאלית גימלון כרומטוגרפית‬
‫אין שינוי בקוטר העמוד‬
‫( “הדרך” שעובר הנוזל הזורם במצע הנקבובי)‬
‫הגדלת אורך העמוד‬
‫גימלון לינארי!‬
‫הגדלת נפח העמוד‪ ,‬נפח הדוגמא‪ ,‬הספיקה ונפח‬
‫האלואנט באותו פקטור ‪ -‬בלי שינוי בזמן ההפרדה‬
‫פרק ‪5‬‬
‫עמוד ‪19‬‬
‫רציפה כרומטוגרפיה‬
‫‪Annular‬‬
‫‪Chromatography‬‬
‫זמן שהייה‬
‫מיקום איסוף התוצר‬
‫אין מגבלה על סוג המילוי‬
‫פרק ‪5‬‬
‫עמוד ‪20‬‬
‫כרומטוגרפיה תעשייתיים עמודי‬
‫זרימה רדיאלית‬
‫פרק ‪5‬‬
‫עמוד ‪21‬‬
‫סיכום חלק ראשון‬
‫‪ ‬תאור תהליכי כרומטוגרפיה בעמוד‬
‫‪ ‬עקרון הפעולה‬
‫‪ ‬עיכוב‬
‫‪ ‬חומרי מילוי שונים‬
‫‪ ‬תאור כמותי של כרומטוגרמות‪ :‬פילוג גאוסיאני‬
‫‪ ‬כלים לחישוב כושר הפרדה‪ ,‬השבה ודרגת טיהור‬
‫פרק ‪6‬‬
‫עמוד ‪22‬‬