Transcript 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 - 生物化学与分子生物学精品课程

大肠杆菌感受态细胞的
制备和转化
一. 实验原理
1. 概念
感受态细胞
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移
到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种
转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另
一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，
需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，
细胞膜、的通透性发生暂时性改变 ， 成为能允许外源
DNA 分子进入的细胞，称感受态细胞。
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转 化
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入
受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它
是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域
的基本实验技术。
2. 转化过程
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 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异
株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可
以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)
等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改
变 , 成 为 能 允 许 外 源 DNA 分 子 进 入 的 感 受 态 细 胞
(Compenent cells)。
 进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的
转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转
化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
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3.常用的感受态细胞制备方法
RbCl(KCl)法， CaCl2法，电击感受态制备等
 RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,
但制备较复杂
 电击感受态细胞转化效率高,但需电击仪
 CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足
一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,
可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半
年),因此CaCl2法为使用更广泛.
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4. CaCl 2 法制备感受态细胞原理
CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基
础，其基本原理是：细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl2 低
渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物
中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘
附于细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞
吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基
中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表
型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后
将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，
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倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。
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5. 提高转化效率的几个因素
1） 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或
储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌
种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度
以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600
来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107
个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密
度过高或不足均会影响转化效率。
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2） 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应
主要 是超 螺旋 态DNA(cccDNA)。转化效率与外源
DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源
DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。
1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。
一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体
积的5％。
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3） 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是
最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保
存于干燥的冷暗处
4） 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程
均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头
等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要
灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所
污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以
后 的 筛 选 、 鉴 定 带 来 不 必 要 的 麻 烦 。
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二. 材料，设备及试剂
1）材料
E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；
质粒DNA: 购买或实验室保存
2）设备
恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工
作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移
液枪， eppendorf管等。
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3. 试 剂
1.LB液体培养基：LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称
取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，
NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5,
加 去 离 子 水 至 总 体 积 1 升 , 高 压 下 蒸 气 灭 菌 20 分 钟 。
2. LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高
压灭菌。
3.Amp母液：氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成
100mg/ml水溶液, -20℃保存备用。
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4.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压
灭 菌 后 冷 却 至 60℃ 左 右 , 加 入 Amp 储 存 液 , 使 终 浓 度 为
100ug/ml,摇匀后到平板。
5.0.1mol/L CaCl2溶液:称取0.56g CaCl2(无水,分析纯),
溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
6.含75%甘油:75ml甘油,用去离子水定容至100ml,高压
灭菌。
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三. 操作步骤
本 实 验 以 E.coli DH5a 菌 株 为 受 体 细 胞 , 并 用
CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与质粒共保温,实现
转化。由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，
可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入
质粒，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp
培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了质
粒。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电
泳、酶切等进一步鉴定。
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1. 受体菌的培养
1) 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接
种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,
直至对数生长后期。（图1）
2) 将该菌悬液以合适的比例接种于100ml LB液体培
养基中,37℃振荡培养1－2小时至OD600=0.3－0.4 。
3) 无菌条件下倒入预冷1.5ml离心管中，4℃, 8000rpm
离心5min (每次1ml，共4次）
4) 彻底弃上清液，在冰浴上加入1/10V（400ul）预冷
的无菌CaCl2 (0.lmol/L)使细胞悬浮,冰浴10 min；
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5) 4℃ ,8000 rpm离心5min，弃上清液;
6) 用160μl预冷的无菌CaC12 (O.lmol/L)和40μl无菌75%
甘油重新悬浮细胞（液氮冷激10 min后，-70℃保存备用）;
2. 转化
1) 取200μl感受态细胞悬液,在冰浴中使其解冻。
2) 加入3μl适量连接产物（质粒DNA溶液）(含量不
超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置10分钟。
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3) 42℃水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3
分钟。
4) 向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后
37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质
粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
5) 将上述菌液摇匀后取适量涂布于含Amp的筛选平
板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒
置培养皿,37℃培养16-24小时(图2)。
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