Transcript 第11讲高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因

YANGTZE NORMAL UNIVERSITY
仪器分析实验
主讲：江 虹
[email protected]
化学化工学院
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荧光法测定维生素B2药物中
核黄素含量
【实验目的】
•
1．了解荧光分光光度计的主要
结构及工作原理。
•
2．掌握荧光分析方法。
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【实验原理】
•
维生素B2 在230～490 nm范围波长的光照
射下，激发出峰值在526 nm左右的绿色荧光，
在 pH为 6～7范围内荧光强度最大。基于上述
性质建立核黄素的荧光分析法，选择合适的激
发波长、荧光波长和实验条件，即可进行定量
测定。
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•
在稀溶液中，当入射光强度、样
品池厚度、仪器工作条件不变时，测
得的荧光强度与荧光物质的浓度成正
比。
•
If = κc
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【实验步骤】
• 1. 实验条件的选择
•
•
（1）激发光波长和荧光波长的选择
25 mL 比色管 + 1.00 mL 100 μg·mL－1 核
用5% HAc 溶液稀至刻度
转移部分于
黄素标准溶液 ————————→ 摇匀——→
比色皿中
• 固定荧光波长526 nm—→扫描激发波长（220～500
nm ）。
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•
固定激发波长为442 nm —→扫
描荧光波长（400～700 nm 范围），
确定最大荧光强度。
•
反复：固定激发扫发射，固定
发射扫激发，确定最佳激发和发射
波长。
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（2）酸度的选择 （25 mL 比色管）
编号
1
2
3
核黄素(mL)
100μg·mL－1
1.00
1.00
1.00
1∶1 盐酸
稀至25 mL 刻度
试剂
5% 醋酸
稀至25 mL 刻度
稀至25 mL 刻度
10％氢氧化钠
pH
λex = 442 nm
λem = 526 nm
If
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2．标准曲线的绘制（25 mL 比色管）
编号
3
4
5
6
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
稀至
刻度
稀至
刻度
稀至
刻度
稀至
刻度
稀至
刻度
1
2
100μg·mL－1
核黄素(mL)
0.00
最佳pH 溶液
（5% 醋酸）
稀至
刻度
试剂
λex = 442 nm，
λem = 526 nm
If
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• 3．样品测定
（1） 药片
① 50 mL烧杯 + 1 片维生素B2 + 约 12 mL 5
用玻棒捣碎药片
％醋酸溶液 ————————→ 取下冷却—
水浴上加热，使样品完全溶解
转入50 mL 容量瓶
——————→
+ 5% 醋酸溶液稀至刻度，摇
匀。
•
离心分离
② 离心管 + 数mL（1）中的溶液——— 。
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③ 25 mL 比色管 + 1.00 mL 离心
液（用移液管准确移取）+ 5％醋酸
溶液稀至刻度，摇匀——→ 测荧光
强度。
•
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（2）注射液
•
① 取VB2 注射液1支，将内容物置于
50 mL 容量瓶中 + 5% 醋酸溶液稀至刻度，
摇匀，即为分析液（已配好）。
•
② 25 mL 比色管 + 1.00 mL VB2 分析
液（用移液管准确移取）+ 5％醋酸溶液
稀至刻度，摇匀。————→ 测荧光强
度。
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• 在标准曲线上查出核黄素的浓度
并根据样品取样量和稀释倍数，
计算出维生素B2中核黄素的含量
（mg·片－1或mg·支－1 ）。
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【注意事项】
维生素B2水溶液遇光易变质，
标准溶液应新鲜配制，维生素B2的
碱性水溶液亦易变质。
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【思考题】
•
1．试述荧光分光光度计与紫外-可见分光
光度计在结构上有哪些不同点？
•
2．在选择最佳激发光波长和荧光波长时，
为何需要反复测量激发光谱和发射光谱？
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1.0
4
0.8
3
0.6
A
5
0.4
2
0.2
1
0.0
200
250
300
¦Ë/nm
维生素C的紫外光谱图(λmax=264nm)
维C：100μg/mL（0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mL）
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1.0
0.8
If
0.6
Ñù
0.4
If = 0.0003893 + 0.09222c
r = 0.9999
0.2
0.0
0
2
4
6
c £¨¦Ìg/mL£©
标准曲线
8
10
实验报告格式
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样品
编号
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
100μg·mL-1
核黄素(mL)
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
最佳pH 溶液
（5% 醋酸）
稀
至
刻
度
稀
至
刻
度
稀
至
刻
度
稀
至
刻
度
稀
至
刻
度
稀
至
刻
度
稀
至
刻
度
稀
至
刻
度
稀
至
刻
度
稀
至
刻
度
稀
至
刻
度
C
0.0
（μg·mL-1）
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
λex = 442 nm，
λem = 526 nm
If
样品
平均值
（μg/mL）
mg/
支
RSD
%
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含量为标示量的90.0%～110.0%范围
均属允许范围。