Transcript Document

NOÄI QUI PHOØNG THÖÏC HAØNH SINH HOÙA
1. SV phaûi coù maët taïi phoøng thí nghieäm ñuùng giôø aán ñònh. Nhöõng SV ñeán treã
10 phuùt keå nhö vaéng maët (khoâng thöïc taäp buø). SV phaûi laøm ñaày ñuû caùc baøi
thöïc taäp vaø ñaït yeâu caàu phaàn thöïc taäp môùi ñuû ñieàu kieän döï thi phaàn lyù
thuyeát.
2. Trong moãi buoåi thöïc taäp, caùc SV trong nhoùm ñöôïc chia thaønh 4 tieåu nhoùm
(khoaûng 4-5 SV) vaø moãi tieåu nhoùm thöïc hieän moät baøi thöïc taäp, nhöng moãi SV
phaûi töï laøm heát taát caû caùc noäi dung cuûa baøi thöïc taäp ñoù. Tröôùc khi ñeán
phoøng thöïc taäp, SV caàn nghieân cöùu kyõ noäi dung, yù nghóa cuûa baøi thöïc taäp
saép laøm, khoâng neân tieán haønh caùc baøi thöïc taäp moät caùch maùy moùc, thuï
ñoäng.
3. Moãi tieåu nhoùm ñöôïc söû duïng vaø chòu traùch nhieäm veà nhöõng duïng cuï, hoùa
chaát cuûa baøi thöïc taäp ñang laøm. Cuoái moãi buoåi thöïc taäp, SV phaûi röûa duïng cuï,
laøm veä sinh, xeáp ñaët choã thöïc taäp goïn gaøng, noäp baøi töôøng trình vaø baøn giao
cho giaùo vieân phuï traùch xaùc nhaän tröùôc khi ra veà.
4. Trong khi laøm thöïc taäp, SV phaûi giöõ traät töï, saïch seõ vaø yeân laëng. Khi chöa
ñöôïc söï höôùng daãn cuûa giaùo vieân, tuyeät ñoái khoâng toø moø söû duïng caùc duïng
cuï ñieän, caùc maùy moùc ñieän töû cuûa phoøng thöïc taäp.
5. Sau moãi buoåi thöïc taäp, moãi sinh viên ñeàu phaûi laøm baøi töôøng trình (theo
maãu) vaø noäp cho giaùo vieân phuï traùch vôùi caùc noäi dung: giaûi thích nhöõng noäi
dung ñaõ laøm, nhöõng noäi dung chöa roõ hay neâu nhöõng thaéc maéc neáu coù…
6. Vaøo phoøng thöïc taäp phaûi maëc aùo blouse.
PHIẾU THỰC HÀNH SINH HÓA
Họ và tên sinh viên : NGUYỄN THỊ NGUYỆT ÁNH
Lớp TC05TY
Tổ : I
Nhóm : 01
Ngày: 24 – 12 – 2007.
Thực hành bài : Thực nghiệm về glucid
PHẦN TƯỜNG TRÌNH
1. Phaûn öùng Molisch – Xác định sự có mặt của glucid trong mẫu xét
nghiệm.
Ghi nhaän keát quaû:
 fructose : +
 saccharose
:+
 tinh bột
:+
3. Phaûn öùng Benedict- xaùc ñònh tính khöû của đường
Ghi nhaän keát quaû:
 fructose : +
 saccharose :  tinh bột
:-
MỤC LỤC
Trang
Bài 1
Bài 2
Bài 3
Bài 4
Thực nghiệm về glucid
Thực nghiệm về lipid và enzyme
Thực nghiệm về protein và amino
acid
Thực nghiệm về vitamin và chất
khoáng
01
07
12
20
BAØI 1. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ GLUCID
1. PHAÀN ÑÒNH TÍNH
1.1. P/ư Molisch : xaùc ñònh söï coù maët của glucid trong maãu xeùt nghieäm
1.2. P/ư Seliwanoff :xác ñònh söï coù maët cuûa caùc đường đơn thuoäc
nhoùm ketose
1.3.P/ư Benedict: xaùc ñònh tính khöû của đường
1.4. Khảo sát tinh bột
1. P/ư maøu cuûa tinh boät vôùi iod
2. P/ư phaân giaûi tinh boät
2. PHAÀN ÑÒNH LÖÔÏNG GLUCID
• Ñònh haøm löôïng glucose trong maùu (theo Somogyi-Nelson)
BAØI 1. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ GLUCID
1. PHAÀN ÑÒNH TÍNH
1.1. Phaûn öùng Molisch
Laø phaûn öùng xaùc ñònh söï coù maët của các aldoses và ketoses trong maãu xeùt
nghieäm
 . Nguyeân taéc
Döôùi taùc duïng cuûa H2SO4 ñaäm ñaëc, polysaccharide ñöôïc phaân giaûi taïo thaønh caùc phaân
töû monosaccharide, saûn phaåm naøy seõ taïo laäp caùc nhaân furfural hay hydroxymethyl
furfural. Nhaân furfural taïo phöùc chaát vôùi . naphtol trong thuoác thöû Molisch döùôi daïng
voøng nhaãn maøu tím giöõa 2 lôùp dung dòch.
P ent ose
Hexose
H2SO 4
H2SO 4
Furfural
O
Hydroxy met hyl fu
HO - CH2 -
CHO
O
-naphthol
Phức chất màu tím
CHO
.. Hoùa chaát
 Thuoác thöû Molisch
 Dung dòch glucid 1%:
glucose,
fructose,
saccharose,
tinh bột
 H2SO4 ñaäm ñaëc
Caùch laøm
Duøng pipette huùt :
 1 ml glucose 1% cho vaøo oáng nghieäm lôùn cỡ 10 ml
 5 giọt thuoác thöû Molisch, laéc ñeàu.
 Ñaët nghieâng oáng nghieäm, laáy caån thaän 1 ml H2SO4 ñaäm ñaëc cho chaûy doïc
thaønh oáng.
Quan saùt voøng nhaãn maøu tím giöõa 2 lôùp dung dòch.
 Laëp laïi phaûn öùng vôùi caùc loaïi glucid 1% khaùc :
 fructose
 saccharose
 tinh bột
Ghi nhaän keát quaû.
1.2. Phaûn öùng Seliwanoff
Laø phaûn öùng xaùc ñònh söï coù maët cuûa caùc đường đơn thuoäc
nhoùm ketose (nhö fructose,xylulose, ribulose).
 . Nguyeân taéc
Trong moâi tröôøng HCl ñaäm ñaëc, fructose taïo thaønh saûn phaåm
dihydroxymethyl furfural, saûn phaåm naøy seõ phaûn öùng vôùi resorcinol taïo
thaønh phöùc chaát maøu ñoû.
 . Hoùa chaát
- Thuoác thöû Seliwanoff (resorcinol trong HCl ñaäm ñaëc)
- Dung dòch glucid 1%:glucose, fructose, saccharose, tinh bột…
HO
HOHC CHOH
HO-H C-C CH-CH OH HCl ññ
2
2
-3H2O
O OH
Resorcinol
HC
HOH2C
Fructose
OH
CH
O
CH2OH
Dihydroxymethyl fucfural
Phöùc
chaát
maøu
ñoû
 . Caùch laøm
Duøng pipette huùt :
 1 ml dung dòch fructose 1% cho vaøo oáng nghieäm lôùn,
 5 ml thuoác thöû Seliwanoff, laéc ñeàu.
 Ñun treân ñeøn coàn, vöøa ñun vöøa laéc nheï.
Quan saùt maøu ñoû xuaát hieän ñaäm daàn leân.
 Laëp laïi phaûn öùng vôùi caùc dung dòch glucid coøn laïi:
- glucose
- lactose
- maltose
- saccharose…
Ghi nhaän keát quaû.
1.3. Phaûn öùng Benedict
đôi.
Laø phaûn öùng xaùc ñònh tính khöû của các đường đơn và đường
. Nguyeân taéc
 Aldehyde + th/thử Benedict → muối của carboxylic acid
+ Cu2O (đỏ gạch)
 Tất cả các aldoses với nhóm chức CHO ở C1 đều là đường
khử
Cu 2+ + Glucose
Môi tr kiềm, to
Cu2O + Muối của acid gluconic
 . Hoùa chaát
 Thuoác thöû Benedict (dung dòch CuSO4 trong moâi tröôøng kieàm sodium
carbonate vaø sodium citrate).
 Dung dòch glucid 1%:
glucose,
fructose,
saccharose,
tinh boät…
 . Caùch laøm
Duøng pipette huùt :
 1 ml dung dòch glucose 1% cho vaøo oáng nghieäm lôùn,
 5 ml thuoác thöû Benedict, laéc ñeàu.
 Ñun vaø laéc nheï treân ñeøn coàn.
Quan sát sự đổi màu của dung dịch và giải thích :
xanh dương → đục → vàng → đỏ gạch (tủa) → đen
 Laëp laïi phaûn öùng vôùi caùc dung dòch ñöôøng coøn laïi :
- fructose,
- saccharose,
- lactose,
- tinh bột...
Ghi nhaän keát quûa.
1.4. Phaûn öùng ñònh tính tinh boät (amidon)
1.4.1. Phaûn öùng maøu cuûa tinh boät vôùi iod
 . Nguyeân taéc
Tinh boät (amidon) ñöôïc caáu taïo töø caùc caáu töû -D-glucose lieân keát laïi vôùi
nhau baèng lieân keát glucosidic (1 4) taïo maïch thaúng amylose vaø (1 6) taïo maïch
nhaùnh amylopectin. Maïch thaúng amylose trong dung dòch coù caáu truùc xoaén  vôùi
ñöôøng kính khoaûng 4-5Ao vaø taïo phaûn öùng maøu ñaëc tröng khi phaân töû iod loït vaøo
trong voøng xoaén ôû nhieät ñoä phoøng.
 . Hoùa chaát
- Dung dòch lugol (iod + KI)
- Dung dòch tinh boät 1%
- Dung dòch sodium thiosulfate (Na2S2O3) 1%
CAÁU TRUÙC HAÏT TINH BOÄT
CAÁU TRUÙC XOAÉN CUÛA MAÏCH AMYLOSE
ñöôøng kính khoaûng 4-5Ao
 . Caùch laøm :
Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống :
 5 ml dung dòch tinh boät 1%,
 2 gioït dung dòch lugol, laéc ñeàu. Quan saùt maøu xanh aùnh naâu (maøu xanh
chaøm)
Ống 1 : Ñun vaø laéc nheï treân ñeøn coàn ñeán khi maøu xanh chaøm bieán maát.
 Ñaët oáng nghieäm döôùi voøi nöùôc ñeå laøm laïnh, quan saùt maøu xanh chaøm có
xuaát hieän trôû laïi không ? Tại sao?
 Ống 2 :
 cho vaøi gioït Na2S2O3 vào, laéc ñeàu,
 quan saùt maøu xanh chaøm có bieán maát không?.
Giải thích.
1.4.2. Phaûn öùng phaân giaûi tinh boät
 . Nguyeân taéc
Trong moâi tröôøng acid ñaäm ñaëc vaø nhieät ñoä cao, caùc lieân keát glucosidic
giöõa caùc caáu töû -D-glucose bò beû gaõy, giải phoùng caùc phaân töû -D-glucose.
Tinh boät ñaõ thuûy phaân khoâng cho phaûn öùng maøu ñaëc hieäu vôùi iod.
 . Hoaù chaát
- Dung dòch tinh boät 1%
- H2SO4 ñaäm ñaëc
- Dung dòch phenolphtalein 1%
- Dung dòch sodium hydroxyde (NaOH) 10%
 . Caùch laøm
1)
Thủy phân tinh bột

5 ml dung dòch tinh boät 1% + 5 gioït H2SO4, laéc ñeàu.

Ñun treân ñeøn coàn, vừa đun vừa laéc nheï 2 phút.

Xác định dung dịch đã thủy phân hoàn toàn hay chưa thì
nhoû 1 gioït iod leân gaïch men vaø laáy 1 gioït dung dòch ñang ñun nhỏ lên giọt
iod, troän ñeàu, quan saùt maøu xanh chaøm coù xuaát hieän khoâng? Neáu còn
maøu xanh chaøm, tieáp tuïc ñun theâm 1 phuùt vaø thöû laïi vôùi iod.
2) Hoàn thành mẫu tinh bột đã thủy phân
 Laøm laïnh oáng nghieäm döôùi voøi nöôùc,
 Theâm 5 ml nöôùc caát vaø 1 gioït phenolphtalein 1%, laéc ñeàu.
 Nhoû töøng gioït NaOH 10%, laéc ñeàu, ñeán khi coù maøu hoàng thaät nhaït.
3) Thử phản ứng : dung dòch tinh boät ñaõ thuûy phaân ñöôïc duøng laøm maãu thöû
nghieäm phaûn öùng Seliwanoff vaø Benedict.
Ghi nhaän keát qủa :
- Phaûn öùng Seliwanoff : (+) hay (-) ? Tại sao?
- Phaûn öùng Benedict : (+) hay (-) ? Tại sao?
.2. PHAÀN ÑÒNH LÖÔÏNG GLUCID
Ñònh haøm löôïng glucose trong maùu (theo Somogyi-Nelson)
 . Nguyeân taéc
 Protein trong maùu ñöôïc sa laéng baèng dung dòch sulfate keõm vaø barium hydoxyde.
 Glucose maùu seõ khöû Cu2+ trong moâi tröôøng kieàm tính, thaønh laäp Cu2O.
 Saûn phaåm Cu2O phaûn öùng vôùi hoãn hôïp arsenomolybdate (maøu vaøng chanh)
taïo thaønh arsenomolybdous (maøu xanh).
Tuøy vaøo möùc ñoä maøu ñaäm nhaït ñöôïc xaùc ñònh töø quang phoå keá ta
suy ra haøm löôïng glucose trong maùu theo ñöôøng chuaån.
 . Hoaù chaát
- Maùu khaùng ñoâng
- Dung dòch sulfate keõm 5%
- Dung dòch barium hydroxyde 0.3N
- Dung dòch Somogyi (CuSO4 + muoái Rochelle + NaOH )
- Dung dòch Nelson (ammonium molybdate + H2SO4)
- Dung dòch glucose chuaån 0,05mg/ml
. Caùch laøm
1) Xử lý mẫu : loại protein, thu mẫu chỉ chứa glucose
 Cho vaøo oáng nghieäm ly taâm 1,5ml nöôùc caát,
 0,1ml maùu khaùng ñoâng : duøng micropipette để huùt, duøng goøn lau saïch maùu
quanh ngoaøi oáng huùt, cho maùu vaøo oáng nghieäm treân (chuù yù khoâng ñöôïc
thoåi phaàn maùu coøn soùt laïi trong micropipette), laéc ñeàu.
 0.2 ml dung dòch barium hydroxyde 0.3N, laéc ñeàu,
 0.2 ml dung dòch sulfate keõm 5%, laéc ñeàu.

Duøng moät oáng nghieäm khaùc coù löôïng nöôùc baèng vôùi oáng maùu, caû hai cho
vaøo maùy ly taâm, ly taâm 3000 voøng/phuùt trong 5 phuùt. Chú ý : đặt 2 ống
đối xứng nhau trong máy
2) Làm phản ứng
Duøng 3 oáng nghieäm lôùn, ñaùnh daáu thöù töï vaø cho vaøo moãi oáng:
- oáng 1 : 1ml nöôùc caát
- oáng 2 : 1 ml dung dịch mẫu đã xử lý
- oáng 3 : 1 ml dung dòch glucose chuaån
 cho vaøo moãi oáng treân 2ml dung dòch Somogyi, laéc ñeàu,
 ñaët vaøo nöôùc noùng 70-1000C trong 20 phuùt, laøm laïnh caû 3 oáng,
 theâm vaøo moãi oáng 2ml dung dòch Nelson, laéc ñeàu,
 cho 10 ml nöôùc caát vaøo caùc oáng ñeå pha loaõng, ñeå yeân 5 phuùt.
3) Đọc kết qủa
So maøu baèng quang phoå keá vôùi böùc soùng  = 520nm :
- Duøng oáng 1 ñeå caân baèng maùy
- Ño trò soá T (ñoä haáp thu quang phoå) cuûa oáng 2 vaø oáng 3
- Tính keát quaû theo coâng thöùc:
T2/T3 x 0.05 x 100/0.05 = mg glucose/100 ml maùu
T2
: ñoä haáp thu quang phoå cuûa oáng 2
T3
: ñoä haáp thu quang phoå cuûa oáng 3
0.05 : noàng ñoä cuûa glucose chuaån
100 : tính trong 100 ml maùu
0.05 : theå tích maùu söû duïng trong phaân tích
Baøi 2. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ LIPID VAØ ENZYME
1. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ LIPID
1.1. Khaûo saùt tính hoøa tan vaø nhuõ hóa môõ
1.2. Khaûo saùt saéc toá maät
- Phaûn öùng Gmelin : mật + HNO3
- Phaûn öùng Smith : mật + dd I trong cồn
1.3. Khaûo saùt theå ketone
- Phaûn öùng Legal
- Phaûn öùng Rothera
2. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ ENZYME
2.1. Khaûo saùt catalase trong maùu
2.2. Khaûo saùt hoaït löïc amylase trong huyeát thanh
1. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ LIPID
1.1. Khaûo saùt tính hoøa tan vaø nhuõ hoaù môõ
 . Nguyeân taéc
Lipid coù tính chaát khoâng tan trong nöôùc do coù söùc caêng beà maët cao, chuùng
chæ tan trong dung moâi höõu cô nhö alcohol, acetone, bezen… Ñeå laøm giaûm söùc caêng
beà maët lipid trong hoãn hôïp lipid-nöôùc, chuùng ta coù theå duøng caùc chaát nhö muoái
kieàm, xaø phoøng, maät… vaø hoãn hôïp seõ coù maøu traéng ñuïc nhö söõa (nhuõ töông),
lipid ôû döôùi daïng nhöõng haït nhoû li ti (haït micell), hieän töôïng naøy ñöôïc goïi laø
hieän töôïng nhuõ hoùa.
 . Hoùa chaát
- Daàu thöïc vaät hoaëc môõ ñoäng vaät
- Dung dòch xaø phoøng, maät pha loaõng
- Dung moâi höõu cô: alcohol, acetone
. Caùch laøm
 Quan sát sự hòa tan – Cho vào 2 ống nghiệm :
 Ống 1 : 2 ml alcohol
 Ống 2 : 2 ml acetone
 Cho vào mỗ ống 1 giọt dầu hoặc mỡ, lắc nhẹ.
Quan sát sự hòa tan của lipid trong hai loại dung môi
 Quan sát sự nhũ hóa
Cho vaøo 4 oáng nghieäm :
 oáng 1 : 1ml nöôùc caát
 oáng 2 : 1 ml xaø phoøng
 oáng 3 : 1 ml sodium benzoate
 oáng 4 : 1ml maät pha loaõng
Cho vaøo moãi oáng 1 gioït daàu hoaëc môõ, laéc ñeàu.
Quan saùt hieän töôïng nhuõ hoùa ôû caùc oáng 2, 3 và 4.
1.2. Khaûo saùt saéc toá maät
 . Nguyeân taéc
Bilirubin vaø biliverdin laø caùc saéc toá maät, taïo ra maøu vaøng xanh cuûa maät.
Döôùi taùc duïng cuûa HNO3 ñaäm ñaëc hoaëc iod, saéc toá maät bò oxy hoùa taïo saûn
phaåm coù maøu ñaëc tröng.
 . Hoùa chaát
- Maät pha loaõng
- HNO3 ñaäm ñaëc
- Dung dòch iod 0.5% trong alcohol
 . Caùch laøm
Phaûn öùng Gmelin:
 Huùt 2 ml maät pha loaõng cho vaøo oáng nghieäm lôùn,
 Đaët nghieâng oáng nghieäm, laáy caån thaän 1ml HNO3 cho chaûy töø töø doïc theo
thaønh oáng.
 Quan saùt söï thay ñoåi maøu ôû phaàn döôùi oáng nghieäm. Ghi nhaän keát quaû.
Phaûn öùng Smith:
 Huùt 2 ml maät pha loaõng cho vaøo oáng nghieäm lôùn,
 Đaët nghieâng oáng nghieäm, cho dung dòch iod chaûy töø töø doïc theo thaønh oáng.
 Quan saùt söï thay ñoåi maøu treân beà maët dung dòch. Ghi nhaän keát quaû.
1.3. Khaûo saùt theå ketone
 . Nguyeân taéc
Theå ketone trong maùu ñoäng vaät goàm acetone, acetoacetic acid, -hydroxy
butyric acid. Haøm löôïng theå ketone trong maùu gia taêng khi coù söï roái loaïn bieán
döôõng. Theå ketone taïo phöùc chaát maøu ñaëc tröng vôùi sodium nitroprusside trong moâi
tröôøng kieàm tính.
 . Hoùa chaát
- Dung dòch ketone
- Boät ammonium sulfate
- Dung dòch sodium nitroprusside 2% - Ammoniac ñaäm ñaëc
- NaOH 10%
 . Caùch laøm
Phaûn öùng Legal:
 Cho 2ml dung dòch ketone vaøo oáng nghieäm lôùn,
 1 ml dung dòch sodium nitroprusside, laéc ñeàu,
 Kiềm hóa bằng vaøi gioït NaOH 10%, laéc ñeàu.
 Quan saùt maøu ñoû cam.
Ghi chuù: Phaûn öùng Legal cho kết qủa döông tính vôùi caùc dung dòch ketone và cả
với creatine vaø creatinine.
Phaûn öùng Rothera:
 Cho 2ml dung dòch ketone vaøo oáng nghieäm lôùn,
 Cho dần boät ammonium sulfate, khuaáy ñeàu ñeán khi baõo hoøa,
 Theâm 2 ml dung dòch sodium nitroprusside, 1 ml ammoniac,
laéc ñeàu,
 Quan sát :
- phaûn öùng maøu tím vôùi acetone,
- maøu ñoû cam vôùi acetoacetic acid ,
- khoâng maøu vôùi creatinine.
2. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ ENZYME
2.1. Khaûo saùt catalase trong maùu
 . Nguyeân taéc
Catalase laø enzyme thuoäc lôùp oxidoreductase, hieän dieän trong nhieàu moâ baøo
ñoäng vaät nhö gan, hoàng caàu… coù taùc duïng ngaên chaän söï tích luõy hydrogen
peroxide trong maùu vaø trong moâ baøo theo phaûn öùng:
H2O2
 . Hoùa chaát

Catalase
- Maùu khaùng ñoâng pha loaõng
- Dung dòch hydrogen peroxid (H2O2) 1%
- Dung dòch sodium cyanide (NaCN) 5%
H2 O + ½ O 2
 . Caùch laøm
Laáy 3 oáng nghieäm lôùn ghi soá thöù töï :
OÁng 1
OÁng 2
OÁng 3*
- Maùu khaùng ñoâng
1 ml
1 ml
1ml*
- NaCN 5%
5 gioït
-
-
- H2O2 1%
1 ml
1 ml
1 ml
(OÁng soá 3* : maùu khaùng ñoâng pha loaõng, phaûi ñun caùch thuûy hoaëc ñun treân ñeøn
coàn 2 phuùt).
Quan saùt hieän töôïng suûi boït (taïo thaønh khí O2 töï do) ôû caùc oáng nghieäm. Ghi
nhaän keát quaû.
2.2. Khaûo saùt hoaït löïc amylase trong huyeát thanh
 . Nguyeân taéc
Döôùi taùc duïng cuûa amylase, tinh boät bò thuûy phaân thaønh nhöõng caáu töû
nhoû hôn laø dextrin hay thuûy phaân ñeán saûn phaåm cuoái cuøng laø maltose vaø glucose.
Phaûn öùng maøu ñaëc tröng giöõa iod vôùi tinh boät vaø dextrin cuõng khaùc nhau. Döïa
vaøo nguyeân taéc naøy ñeå xaùc ñònh hoaït löïc cuûa amylase.
Phaûn öùng:
Tinh boät Amylase
 Dextrin  Maltose
+I2
+ I2
+ I2
Maøu xanh chaøm
Maøu naâu
Khoâng maøu
Glucose
Maltase
+ I2
Khoâng maøu
 . Hoùa chaát
- Huyeát thanh
- Dung dòch NaCl 0.9%
- Dung dòch iod 0.5% trong alcohol
- Dung dòch tinh boät 1%
 . Caùch laøm
Duøng 9 oáng nghieäm lôùn ghi soá thöù töï töø 1 ñeán 9, cho moãi oáng 1 ml NaCl
0.9%. Pha loaõng noàng ñoä huyeát thanh (amylase) baèng caùch duøng pipette huùt chính
xaùc 1ml huyeát thanh cho vaøo oáng 1, laéc ñeàu (oáng 1 coù huyeát thanh pha loaõng noàng
ñoä ½). Huùt chính xaùc 1 ml hoãn hôïp ôû oáng 1 cho vaøo oáng 2, laéc ñeàu (huyeát thanh
pha loaõng noàng ñoä ¼). Huùt chính xaùc 1 ml hoãn hôïp ôû oáng 2 cho vaøo oáng 3…
tieáp tuïc pha loaõng ñeán oáng 9. Huùt chính xaùc 1 ml hoãn hôïp ôû oáng 9 boû ñi.
Hóa chất
NaCl 0.9%
H.thanh
Tinh bột
1
1
1
2
Số thứ tự các ống nghiệm
2 3 4 5 6 7 8
1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1
2 2 2 2 2 2 2
9
1
1
2
 Ñaët taát caû 9 oáng vaøo nöôùc aám 370C trong 60 phuùt
 Nhoû 1 gioït dung dòch iod vaøo moãi oáng, laéc ñeàu
 Quan sát söï thay ñoåi maøu (chuù yù: soá thöù töï cuûa caùc oáng phaûi
ñuùng).
 Ñoïc keát quaû baèng caùch choïn soá thöù töï cuûa oáng coù maøu naâu caïnh oáng
coù maøu xanh, tra baûng ñeå suy ra hoaït löïc amylase trong huyeát thanh xeùt
nghieäm
Hoạt lực amylase
Ống số
1
2
3
4
5
6
7
Đơn vị/ml
4
8
16
32
64
128
256
8
9
512 1024
BAØI 3. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ PROTEIN
VAØ AMINO ACID
1. PHAÀN ÑÒNH TÍNH
1.1. Pư ninhydrin :xaùc ñònh nhoùm -amine (p/ư định tính amino acids) – f/c
màu tím
1.2. Pư biurette : x/đ l/ keát peptide – muối Cu2+ màu tím
1.3. P/ư xanthoproteic:x/đ caùc AA voøng nhö Tyr, Trp
1.4. P/ư Hopkins Cole : x/đ söï hieän dieän cuûa Trp
1.5. Khaûo saùt sự sa laéng vaø bieán tính cuûa protein
2. PHAÀN ÑÒNH LÖÔÏNG
2.1. Ñònh hàm löôïng protein toång soá trong huyeát thanh baèng khuùc xaï keá.
2.2. Ñònh haøm löôïng albumin vaø globulin trong huyeát thanh baèng phöông phaùp
Reinhold (so màu)
2.3. Ñònh haøm löôïng nitrogen amine baèng phöông phaùp Sorenxen (chuẩn độ)
1. PHAÀN ÑÒNH TÍNH
1.1. Phaûn öùng ninhydrin
 . Nguyeân taéc
Phaûn öùng ninhydrin laø phaûn öùng xaùc ñònh nhoùm -amine trong phaân töû
amino acid, protein, caùc saûn phaåm chuyeån hoaù töø protein vaø caùc chaát coù nhoùm amine
khoâng phaûi laø protein (NPN). Ninhydrin taùc duïng vôùi nhoùm amine taïo phöùc chaát
maøu tím. Đây là p/ư thường sử dụng để định tính các amino acids
 . Hoùa chaát
- Thuoác thöû ninhydrin
- Dung dòch amino acid 1%: glycine, alanine, serine.
- Dung dòch protein 1%: loøng traéng tröùng, gelatin.
 . Caùch laøm
 Lấy 2ml dung dòch loøng traéng tröùng 1% cho vaøo oáng nghieäm
 1ml thuoác thöû ninhydrin, laéc ñeàu,
 ñun vaø laéc nheï treân ñeøn coàn. Quan saùt maøu tím.
 Laëp laïi phaûn öùng vôùi caùc dung dòch gelatin, glycine, alanine vaø serine vaø ghi nhaän
keát quaû .
1.2. Phaûn öùng biurette
 . Nguyeân taéc
Phaûn öùng biurette xaùc ñònh sự có mặt của lieân keát peptide (CO-NH) trong
mẫu xét nghiệm (định tính protein, polypeptide). Trong moâi tröôøng kieàm, CuSO4 seõ
phaûn öùng với lieân keát peptide thaønh laäp phöùc hôïp muoái ñoàng nhò maøu tím.
Phöùc hôïp muoái ñoàng nhò maøu tím
 . Hoùa chaát
- Thuoác thöû biurette
- Dung dòch protein 1%: loøng traéng tröùng, gelatin.
- Dung dòch amino acid 1%: glycine, alanine, serine.
 . Caùch laøm
 Lấy 2ml dung dòch loøng traéng tröùng 1% cho vaøo oáng nghieäm
 2ml thuoác thöû biurette, laéc ñeàu,
 ñun vaø laéc nheï treân ñeøn coàn. Quan saùt maøu tím.
 Laëp laïi phaûn öùng vôùi caùc dung dòch gelatin, glycine, alanine vaø serine . Ghi nhaän
keát qủa?
1.3. Phaûn öùng xanthoproteic
 . Nguyeân taéc
Phaûn öùng xathoproteic xaùc ñònh sự có mặt của caùc amino acid voøng nhö
Tyr, Trp trong mẫu xét nghiệm. HNO3 ñaäm ñaëc seõ nitrate hoùa voøng phenolic vaø
indol taïo ra saûn phaåm nitrotyrosine vaø nitrotryptophane coù maøu vaøng, sau ñoù trong
moâi tröôøng kieàm maïnh nhö NH4OH hay NaOH seõ taïo phöùc hôïp maøu cam.
 . Hoùa chaát
- HNO3 ñaäm ñaëc
- NH4OH ñaäm ñaëc
- Dung dòch protein 1%: loøng traéng tröùng, gelatin
OH
OH
OH
O
HNO3
-N
CH2 - CH - COOH
NH2
Tyrosine
NH4OH
O
CH2 - CH - COOH
NH2
Nitrotyrosine
(maøu vaøng)
O - NH4
-N
O - NH4
CH2 - CH - COOH
NH2
i cuû
a acid nitronic
Muoá
(maøu cam)
 . Caùch laøm
 Lấy 2ml dung dòch loøng traéng tröùng 1% cho vaøo oáng nghieäm
 Laáy caån thaän 1ml HNO3 ñaäm ñaëc cho chaûy doïc theo thaønh oáng nghieäm, laéc
ñeàu,
 Đun vaø laéc nheï treân ñeøn coàn, quan saùt maøu vaøng xuaát hieän.
 Laøm laïnh, theâm vaøi gioït NH4OH, maøu vaøng chuyeån ñoåi daàn sang maøu cam.
 Laëp laïi thí nghieäm vôùi dung dòch gelatin.
Ghi nhận keát quaû?
1.4. Phaûn öùng Hopkins Cole
 . Nguyeân taéc
Laø phaûn öùng xaùc ñònh söï hieän dieän cuûa tryptophan. Voøng indol phaûn
öùng vôùi thuoác thöû Hopkins Cole (Mg2+ + oxalic acid) hay chaát para dimethyl
aminobenzaldehyde taïo thaønh phöùc chaát coù maøu tím trong moâi tröôøng acid ñaäm
ñaëc.
 Hóa chất
 Các dung dịch protein và amino acid như thí nghiệm 1
 H2SO4 đâm đặc
 Thuốc thử para dimethylaminobenzadehyde : hòa tan 2
gam thuốc thử trong 100 ml alcohol 950.
 . Caùch laøm
 Lấy 2ml loøng traéng tröùng 1% cho vaøo oáng nghieäm,
 1 ml thuốc thử para dimethylaminobenzadehyde, lắc đều.
 Laáy caån thaän 2 ml H2SO4 đđ cho chaûy từ từ doïc theo thaønh oáng nghieäm
xuống đáy.
 Quan sát vòng tím indol giữa 2 lớp dung dịch. Nếu lắc
mạnh vòng tím sẽ biến mất.
 Laëp laïi thí nghieäm vôùi dung dòch gelatin vaø các amino acid
Ghi nhận keát qủa?
1.5. Khaûo saùt tính chaát sa laéng vaø bieán tính cuûa protein
 . Nguyeân taéc
Protein hoøa tan trong nöôùc taïo thaønh dung dòch keo beàn vöõng nhờ söùc
ñaåy tónh ñieän giöõa caùc haït keo protein mang ñieän tích cuøng daáu vaø lôùp voû thuûy
hoùa. Neáu maát moät trong hai loaïi yeáu toá hoaëc caû hai thì caùc haït keo seõ keát dính
laïi taïo ra hieän töôïng sa laéng vaø protein bò bieán tính. Coù nhieàu caùch laøm sa laéng
protein nhö sa laéng bôûi muoái kieàm, dung moâi höõu cô, kim loaïi naëng, acid maïnh...
 . Hoùa chaát
- Loøng traéng tröùng 1%
- Dung dòch SA baõo hoøa
- Acetone
- Acetate chì 5%
- Trichloroacetic acid 10%
 . Caùch laøm
Duøng 4 oáng nghieäm lôùn ghi soá thöù töï :
Hóa chất
Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4
Lòng trắng trứng
3ml
3ml
3ml
3ml
Ammonium sulfate 3ml
Acetone
3ml
Acetate chì
1ml
Trichloroacetic.A
1ml
Quan saùt vaø so saùnh söï sa laéng vaø bieán tính cuûa loøng traéng tröùng ôû
caùc oáng qua hieän töôïng keát tuûa.
Ghi nhaän keát qủa ?
2. PHAÀN ÑÒNH LÖÔÏNG
2.1. Ñònh haøm löôïng protein toång soá trong huyeát thanh baèng khuùc xaï keá
(Refractometer A/O-USA)
 . Nguyeân taéc
Döïa vào söï khaùc bieät veà ñoä chieát xuaát n giöõa caùc dung dòch huyeát
thanh, aùnh saùng ñi qua dung dòch seõ bò khuùc xaï vaø tia loù qua laêng kính ñöôïc
ñònh laïi qua thò tröôøng laøm ranh giôùi hai vuøng saùng toái, chæ löôïng protein toång
soá treân thöôùc chuaån.
 . Hoùa chaát
- Huyeát thanh
- Acetone
- Nöôùc caát
 . Caùch laøm
 Duøng goøn taåm acetone lau maët kính, sau ñoù röûa laïi nhieàu laàn baèng nöôùc caát
vaø lau laïi baèng goøn khoâ.
 Ñaäy naép nhöïa treân maët laêng kính vaø nhoû moät gioït huyeát thanh vaøo raõnh
ñaäy.
 Nhìn qua thò kính seõ coù ñöôïc thò tröôøng vôùi 2 vuøng: vuøng toái ôû treân vaø vuøng
saùng ôû döôùi. Ranh giôùi hai vuøng caét ngang thöôùc chuaån seõõ xaùc ñònh haøm
löôïng protein toång soá trong maãu huyeát thanh xeùt nghieäm, ñôn vò ño laø g/dl (soá
gram protein trong 100 ml huyeát thanh).
2.2. Ñònh haøm löôïng albumin vaø globulin trong huyeát theo baèng phöông phaùp Reinhold
 . Nguyeân taéc
Tieåu phaàn globulin trong huyeát thanh ñöôïc loaïi boû baèng dung dòch muoái
ammonium sulfate qua söï sa laéng vaø ly taâm taùch laáy phaàn nöôùc trong (chæ coøn tieåu
phaàn albumin).
Sau ñoù duøng dung dòch sulfate ñoàng trong thuoác thöû biurette seõ laøm hieän maøu do
caùc lieân keát peptide cuûa albumin. Ñoä ñaäm nhaït tuøy thuoäc vaøo soá lieân keát peptide
trong dung dịch. Haøm löôïng albumin ñöôïc xaùc ñònh baèng ñoä maät ñoä quang hoïc
(%T) ôû böôùc soùng  = 550 nm.
 . Hoaù chaát
- Huyeát thanh
- Thuoác thöû biurette
- Sodium chloride 0.9%
- Dung dòch ammonium sulfate 23% (hoaëc sodium sulfate 23%)
 . Caùch laøm
Loaïi boû globulin:
 Huùt 0.5 ml huyeát thanh cho vaøo oáng nghieäm lôùn,
 theâm 7.5 ml Na2 SO4 23%, laéc ñeàu, ñeå yeân 5 phuùt,
 ly taâm 3000 voøng/phuùt trong 5 phuùt, loaïi boû caën baèng caùch loïc qua giaáy loïc.
Ñaây laø nöôùc loïc 1 (chæ coøn albumin).
Tìm protein toång soá:
 Huùt 0.5 ml huyeát thanh cho vaøo oáng nghieäm lôùn,
 7.5 ml NaCl 0.9%.
 Laéc ñeàu, ly taâm boû caën (neáu coù). Ñaây laø nöôùc loïc 2.
 Duøng 3 oáng nghieäm lôùn ghi soá thöù töï:
Dung dịch
Nước lọc 1 (albumin)
Nước lọc 2 (protein TS =
albumin + globulin )
Na2SO4 23% (để cân
bằng máy)
Thuốc thử biurette
Ống 1
Ống 2
Ống 3
5ml
-
-
-
5ml
-
-
-
5ml
5ml
5ml
5ml
Ñeå yeân 30 phuùt. Ñoïc trò soá haáp thu %T treân quang phoå keá vôùi  = 550 nm.
- OÁng 3 : Ñeå chænh maùy vôùi ñoä haáp thu = 0
- OÁng 1 : Ñoä haáp thu cuûa albumin.
- OÁng 2 : Ñoä haáp thu cuûa protein toång soá.
* Caùch tính : Ví duï :
- Ñoä haáp thu cuûa albumin
(Abs)
= 11
- Ñoä haáp thu protein toång soâ’(Abs)
= 25
- Protein toång soá
= 7 g%.
Vaäy : Haøm löôïng albumin huyeát thanh laø :
7 x 11
25 = 3,08 g%
Suy ra haøm löôïng globulin huyeát thanh laø :
7,0 - 3,08 = 3,92 g%.
2.3. Ñònh haøm löôïng nitrogen amine baèng phöông phaùp Sorenxen
 . Nguyeân taéc
Nitrogen amine cuûa nhoùm amine töï do trong caùc dung dòch amino acid, peptide
vaø protein thöôøng lieân keát noäi phaân töû vôùi nhoùm carboxyl töï do seõ ñöôïc phong beá
baèng nhoùm formaldehyde ñeå giaûi phoùng nhoùm carboxyl. Nhoùm carboxyl ñöôïc chuaån
ñoä ñònh löôïng baèng dung dòch sodium hydroxyde, töø ñoù giaùn tieáp suy ra löôïng
nitrogen amine.
 . Hoùa chaát
-Dung dòch glycine
NaOH 0.2N
-Formaldehyde trung tính
- Nöôùc caát ñun soâi ñeå nguoäi
- Phenophtalein 0.05% trong alcohol 700
 . Caùch laøm
Laáy 2 bình tam giaùc ghi thöù töï
Dung dịch
Glycine
Bình 1
10 ml
Bình 2
-
Nước cất
-
10 ml
Formaldehyde
5 ml
5 ml
Phenolphtalein
2 giọt
2 giọt
Laéc ñeàu, ñem ñònh chuaån vôùi NaOH 0.2N töø burette ñeán khi coù maøu ñoû tía. Ghi
soá ml NaOH 0.2N ñaõ duøng ñònh chuaån cho moãi bình.
Tính haøm löôïng nitrogen amine theo coâng thöùc :
X (mg/ 10 ml) = (A-B) x 2.,8
X : Số mg nitrogen amine chứa trong 10 ml dung dịch glycine
A : Số ml NaOH định chuẩn bình 1 (glycine)
B : Số ml NaOH định chuẩn bình 2 (nước cất)
2,8 : Số mg nitrogen tương ứng với 1 ml NaOH định chuẩn
BAØI 4. THÖÏC NGHIEÄM VEÀ VITAMIN - KHOAÙNG
CHAÁT
1. Ñònh löôïng vitamin C trong huyeát thanh baèng phöông phaùp chuaån
ñoä 2,6 dichlorophenol indophenol
2. Ñònh löôïng calcium huyeát thanh theo phöông phaùp Clark vaø Colip
(chuaån độ)
3. Ñònh löôïng phospho voâ cô huyeát thanh theo phöông phaùp Urbach va
Raabe (so màu)
1. Ñònh löôïng vitamin C trong huyeát thanh baèng phöông phaùp chuaån ñoä 2,6
dichlorophenol indophenol
 . Nguyeân taéc
Vitamin C khoâng beàn, deã bò oxy hoùa bôûi oxygen cuûa khoâng khí. Trong moâi
tröôøng acid vaø yeám khí vitamin C bền vững. Chaát 2,6 dichlorophenol indophenol coù
maøu xanh döông (daïng oxy hoùa), khi nhaän caëp hydrogen töø ascorbic acid seõ trôû thaønh
khoâng maøu (daïng khöû) vaø trong moâi tröôøng acid yeáu thì saûn phaåm daïng khöû
khoâng maøu seõ coù maøu hoàng nhaït khoâng beàn.
 . Hoùa chaát
- Huyeát thanh
- Metaphosphoric acid 5%
- Thuoác thöû 2,6 dichlorophenol indophenol 0.001N
 . Caùch laøm
Duøng 2 oáng nghieäm ly taâm, ghi soá thöù töï
Dung dịch
Ống 1
Ống 2
Huyết thanh
1 ml
-
Nước cất
3 ml
4 ml
Metaphosphric acid 5%
1 ml
1 ml
 Laéc ñeàu, ly taâm caû 2 oáng vôùi 3000 voøng/phuùt.
 Laáy 3ml nöôùc trong ôû moãi oáng cho vaøo oáng nghieäm nhoû, ñem chuaån ñoä baèng
thuoác thöû 2,6 dichlorophenol indophenol treân microburette ñeán khi coù maøu hoàng nhaït
beàn trong 1 phuùt.
 Ghi soá ml thuoác thöû ñaõ duøng cuûa moãi oáng .
Tính keát quûa :
(A - B ) x 0.088 x 5 x 100 mg%
X=
3
Vôùi : X = Soá mg vitamin C tính trong 100 ml huyeát thanh.
A = Soá ml thuoác thöû ñònh chuaån oáng huyeát thanh.
B = Soá ml thuoác thöû ñònh chuaån oáng nöôùc caát.
0,088 = Số mg vitamin C ứng với 1 ml thuốc thử
4.2. Ñònh löôïng calcium huyeát thanh theo phöông phaùp Clark vaø Colip
. Nguyeân taéc
Calcium trong huyeát thanh ñöôïc taùch bôûi ammonium oxalate taïo thaønh calcium
oxalate. Sau ñoù döôùi taùc duïng cuûa sulfuric acid, calcium oxalate seõ taïo ra 2 saûn phaåm
calcium sulfate vaø oxalic acid. Oxalic acid ñöôïc chuaån ñoä baèng potassium permanganate.
. Hoùa chaát
- Huyeát thanh
- Dung dòch ammonium oxalate 4%
- Dung dòch ammonium hydroxyde 2%
- Dung dòch potassium permanganate 0.01 N
- H2SO4 N
Ca2+ +
COO - NH4
COO


COO-NH4
+
2 NH+4
COO
COO

Ca
COOH
Ca + 2H2SO4
COO
COOH

+ 2KMnO4 + 2H2SO4
COOH

+
CaSO4
COOH
10 CO2 + 2MnSO4 + K2 SO4
+ 8 H 2O
. Caùch laøm
Duøng 2 oáng nghieäm ly taâm, ghi soá thöù töï
Dung dịch
Ống 1
Ống 2
Nước cất
2 ml
-
-
2 ml
Huyết thanh
Ammonium oxalate 4%
1 ml
1 ml
- Laéc ñeàu, ñeå yeân 3 phuùt, ly taâm 3000 voøng/phuùt/5 phuùt. OÁng 1 ñoå heát nöôùc.
- OÁng 2 coù caën calcium oxalate maøu traéng ôû ñaùy oáng nghieäm, duøng pipette Pasteur huùt
caån thaän phaàn nöôùc trong boû ñi (giöõ laáy caën)..
-Rửa căn oxalate Ca : cho vaøo moãi oáng 2 ml ammonium hydroxyde, ly taâm, loaïi boû phaàn
nöôùc trong nhö treân, lặp laïi 2 laàn.
-Hòa tan cặn oxalate ca : cho vaøo moãi oáng 2 ml H2SO4 N, laéc ñeàu, ñaët vaøo nöôùc noùng 7080oC trong 1 phuùt.
Ñònh chuaån baèng dung dòch KMnO4 0.001 N treân microburette (vừa định chuẩn vừa
nhúng ống nghiệm vào nước nóng) ñeán khi coù maøu hoàng nhaït beàn trong 1
phuùt. Ghi soá ml KMnO4 ñaõ duøng cho moãi oáng.
Tính keát quaû: X = (A-B) x 0.2 x 50 mg%
X
= Soá mg Ca coù trong 100 ml huyeát thanh.
•
A = Soá ml KMnO4 ñònh chuaån oáng huyeát thanh.
•
B = Soá ml KMnO4 ñònh chuaán oáng nöôùc caát.
•
0.2 = 1 ml KMnO4 0.01N töông öùng 0.2 mg Ca.
•
50 = 100/2 - tính trong 100 ml huyeát thanh.
3. Ñònh löôïng phospho voâ cô huyeát thanh theo phöông phaùp Urbach va Raabe
. Nguyeân taéc
Phospho voâ cô trong huyeát thanh seõ phaûn öùng vôùi molybdic acid taïo thaønh
saûn phaåm phosphomolybdic acid vaø döôùi taùc duïng cuûa hydroquinon seõ laøm hoaøn
nguyeân vaø taïo ra molybden maøu xanh. Protein trong huyeát thanh seõ hoøa tan bôûi taùc
ñoäng cuûa hoãn hôïp carbonate-sulfite ñeå khoâng caûn trôû quùa trình hình thaønh molybden
blue. Ñoä ñaäm nhaït cuûa dd tyû leä thuaän vôùi haøm löôïng phospho voâ cô trong huyeát
thanh vaø xaùc ñònh baèng quang phoå keá vôùi  = 720 nm.
. Hoùa chaát
- Dung dòch 1 : Sodium sulfite
- Dung dòch 3 : Hydroquinon
- Dung dòch 2 : Ammonium molybdate
- Dung dòch 4 : Sodium carbonate + Sodium sulfite
- Dung dòch phospho chuaån 5mg%
- Huyeát thanh
. Caùch laøm
Duøng 2 oáng nghieäm lôùn, ghi soá thöù töï
Dung dịch
Phospho chuẩn
Huyết thanh
Dung dịch 1
Dung dịch 2
Dung dịch 3
Dung dịch 4
Ống 1
0.2 ml
1 ml
0.5 ml
Để yên 5 phút
0.5 ml
Để yên 5 phút
5 ml
Để yên 5 phút
Ống 2
0.2 ml
1 ml
0.5 ml
0.5 ml
5 ml
Ghi chuù: duøng micropipette ñeå huùt huyeát thanh vaø phospho chuaån
Đo ñoä haáp thu quang phoå vôùi  = 720 nm cuûa moãi oáng.
* Tính keát quûa :
Ví duï : - Ñoä haáp thu oáng phospho chuaån
- Ñoä haáp thu oáng huyeát thanh
= 45%
= 35%
Ta coù :
Ñoä haáp thu = 45% öùng vôùi 5mg% phospho voâ cô.
Ñoä haáp thu = 35% öùng vôùi haøn löôïng phospho voâ cô trong huyeát thanh.
Huyeát thanh seõ coù haøm löôïng phospho voâ cô laø :
X=
5mg % x 35
45