Доповідач: Субін Олександр Володимирович

Науковий керівник: к.с-г.н Антіпов Ігор Олександрович

Мета досліджень: Дослідження молекулярно-біологічних особливостей діагностики вірусу жовтої карликовості ячменю, підбір та оптимізація параметрів проведення полімеразної ланцюгової реакції.

Об’єкт досліджень: Вірус жовтої карликовості ячменю.

З авдання дослідження:

 Провести скринінг посівів сільськогосподарських посівів на предмет пошуку позитивних контролів віруса жовтої карликовості ячменя;  Здійснити біоінфомативний аналіз нуклеотидних консервативних послідовностей генів, що кодують капсидні білки вірусу;  Розробити дизайн праймерів для діагностичних тест-систем;  Провести підбір та оптимізацію параметрів проведення ПЛР для ідентификації віруса жовтої карликовості ячменю;  Проаналізувати стан посівів зернових культур дослідних господарств НУБіП України на наявність ВЖКЯ.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВЖКЯ

ВЖКЯ представлений одно ланцюговою РНК "+" яка складається з 5600 нуклеотидів (в деяких штамах кількість нуклеотидів збільшується до 6500). До складу вірусу входять сферичні шестикутні віріони розмірами 25-28 нм, 2 білки які утворюють капсид для РНК, маса білків 7 кДа(в деяких штамах до 17 кДа) .

1-а підгрупа: • BYDV-MAV • BYDV-PAV • BYDV-SGV 2-а підгрупа: • BYDV-RMV • BYDV-PRV Структура віріону Вірусу жовтої карликовості ячменю (ліворуч). Електронна фотографія віріонів ВЖКЯ (BYDV PAV) методом негативного контрастування (центр, праворуч) Бар 100 нм.

СКРИНІНГ ПОСІВІВ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКИХ ПОСІВІВ НА ПРЕДМЕТ ПОШУКУ ПОЗИТИВНИХ КОНТРОЛІВ ВІРУСА ЖОВТОЇ КАРЛИКОВОСТІ ЯЧМЕНЯ Пшеничне поле з ділянкою відмерлих рослин Діаграма прояву симптомів ураження в посівах пшениці вірусного 40 35 30 25 20 15 10 5 0 16 0,8 7,3 8,5 2,1 9,9 0,3 6,1 6,7 % від загальної кількості 39,2 Фіолетове забарвлення Дрібний колос Пожовтіння листків Хлороз листків Буре забарвлення Міжжилкова мозаїка Некрози Мозаїка на листках Відставання у рості

Результати візуального обстеження дослідних ділянок посівів пшениці сорту “Поліська 90” на предмет ураження вірусними інфекціями № п/п Симптоми Кількість % від загальної кількості 1 Фіолетове забарвлення 55 16 2 Дрібний колос 3 0,8 3 4 5 6 7 8 9 Пожовтіння листків Хлороз листків Буре забарвлення Міжжилкова мозаїка Некрози Мозаїка на листках Відставання у рості 25 29 34 17 1 21 23 7,3 8,5 2,1 9,9 0,3 6,1 6,7 Рослини без симптомів ураження 134 39,2 Всього обстежено рослин 342 100

БІОІНФОРМАТИВНИЙ АНАЛІЗ НУКЛЕОТИДНИХ КОНСЕРВАТИВНИХ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ, ЩО КОДУЮТЬ КАПСИДНІ БІЛКИ ВІРУСУ (на прикладі ВЖКЯ-PAV)

Вирівнювання нуклеотидних послідовностей генів, що кодують капсидні білки різних ізолятів штаму ВЖКЯ-PAV EF521841.1- Швеція; EF521840.1- США; EF521845.1 – Індія; AJ810418.1- Німеччина; EF521838.1 – Канада; EF521842.1 – Китай.

Консервативні нуклеотидні послідовності генів капсидних білків зображені червоним кольором

Розробка праймерів для ПЛР

Локалізація місць гібридизації ВЖКЯ-PAV праймерів на ДНК матриці консенсусної послідовності.

МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ПРАЙМЕРІВ ДЛЯ ДОСЛІДЖЕНЬ ШТАМІВ ВЖКЯ

Штам PAV MAV SGV GAV PAS Полож.на матриці Forward Reverse Forward Reverse Forward Reverse Forward Reverse Forward Reverse Нуклеотидна послідовність5’- 3’ Довж.нук леотидів t відпалу, 0 С GC склад, % Розмір продук-ту, п.н.

GCGGGACTGAGGTATT CGTA TAGCTACCCAGGGCTG ATTG CCAACAGGCAGGACT GAGAT GTGTGCACGAAGTGTC GAGT ACGACATCAAAGGCAA CTCC TTCATCGTGGTCCCGTT AAT AGGAGGAGGGGCAAA TCTTA GCACGAAGTGTCGAGT TCAA CAATCAAATTCGGTCC CAGT GCAGTTTTGCTGATGG TGAA 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 60.10

60.23

60.26

59.95

60.12

60.19

60.03

60.03

59.79

59.85

55.00

55.00

55.00

55.00

50.00

45.00

50.00

50.00

45.00

45.00

178 229 286 253 214

ВИРІВНЮВАННЯ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ ГЕНІВ, ЩО КОДУЮТЬ КАПСИДНІ БІЛКИ РІЗНИХ ШТАМІВ ВЖКЯ

ПІДБІР ТА ОПТИМІЗАЦІЯ ПАРАМЕТРІВ ПРОВЕДЕННЯ ПЛР ДЛЯ ІДЕНТИФИКАЦІЇ ВІРУСА ЖОВТОЇ КАРЛИКОВОСТІ ЯЧМЕНЮ Електрофореграма продуктів ПЛР аналізу визначення вірусу жовтої карликовості ячменю штаму PAV. 1-12 – аналізовані зразки сортів пшениці (1- Антонівка, 2 - Богдана, 3 - Вікторія одеська, 4 - Винничанка, 5 - Василина, 6 Володарка, 7 - Волошкова, 8 – Годувальниця, 9 Одеська 267, 10 – Куяльник, 11 – Господиня, 12 Литанивка); (М) – маркер довжин фрагментів (пар нуклеотидів) Електрофореграма продуктів ПЛР аналізу визначення вірусу жовтої карликовості ячменю штаму PAV. 1-2 – аналізовані зразки сортів пшениці (1- Поліська 90, 2 – Вдала); 3-7 аналізовані зразки сортів ячменя (3 - Гетьман, 4 Геліос, 5 - Адапт, 6 - Вакула, 7 – Скарлет); (М) – маркер довжин фрагментів (пар нуклеотидів).

Результати виявлення ВЖКЯ-PAV в зразках сортів озимої пшениці та ярого ячменю методом ПЛР

Аналізовані сорти Результати випробувань (порівняльна концентрація ) Озима пшениця Антонівка Богдана Вікторія одеська Винничанка Василина Володарка Волошкова Годувальниця Одеська 267 Куяльник Господиня Литанівка Поліська 90 Вдала + + +++ +++ ++ Ярий ячмінь Гетьман Геліос Адапт Вакула Скарлет -

АНАЛІЗ ВІРУСНОГО НАВАНТАЖЕННЯ ПОСІВІВ ЗЕРНОВИХ КУЛЬТУР ДОСЛІДНИХ ГОСПОДАРСТВ НУБІП УКРАЇНИ

Структура посівних площ: ВП НУБіП України "Агрономічна дослідна станція“ (ліворуч), ВП НУБіП України "Великоснітинське НДГ ім. О. В. Музиченка“ (по центру), ВП НУБіП України "Великоснітинське НДГ ім. О. В. Музиченка" Гвардійський відділок (праворуч).

АНАЛІЗ ВІРУСНОГО НАВАНТАЖЕННЯ ПОСІВІВ ЗЕРНОВИХ КУЛЬТУР ДОСЛІДНИХ ГОСПОДАРСТВ НУБІП УКРАЇНИ

Загальний вигляд поля № 4 у Агрономічній дослідній станції.

Поле № 2 ВП НУБіП України "Великоснітинське НДГ ім. О. В. Музиченка" з великими локаціями заражених рослин

ВИСНОВКИ:

1.

Встановлено біологічні характеристики віруса жовтої карликовості ячменя.

2. Проведено скринінг посівів зернових в агроценозах України. Відібрано зразки вегетативної маси рослин з симптомами вірусного ураження.

3. Здійснено біоінформативний послідовностей генів білків аналіз оболонки нуклеотидних штамів 1-ї підгрупи: BYDV-MAV, BYDV-PAV, BYDV-SGV та 2-ї підгрупи: BYDV-RMV, BYDV-PRV карликовості ячменю (ВЖКЯ).

вірусу жовтої

ВИСНОВКИ:

4.

5.

Створено дизайн олігонуклеотидних праймерів для проведення діагностичного ПЛР аналізу ВЖКЯ штамів BYDV-MAV, BYDV-PAV, BYDV-SGV, BYDV-RMV, BYDV-PRV. Синтезовано пару праймерів вірусу жовтої карликовості ячменю штаму PAV Forward 5’ GCGGGACTGAGGTATTCGTA-3’ та Reverse 5’ TAGCTACCCAGGGCTGATTG-3’. Відібрані праймери не виявляли специфічності до нуклеотидних послідовностей геномів інших організмів (з утворенням ПЛР продукту розміром 178 пар нуклеотидів), які занесено до генетичного банку даних.

Розроблено діагностичну тест-систему, на основі полімеразно ланцюгової реакції для ідентифікації вірусу жовтої карликовості ячменю штаму PAV.

ВИСНОВКИ:

6. Оптимізовано умови полімеразної ланцюгової реакції.

Встановлено, що оптимальна концентрація іонів Mg 2+ у реакційній суміші становить 1,7 мМ, температура відпалу праймерів 60 0 С.

Оптимальне значення концентрації праймерів складало 5 пкМ.

7. Проведено моніторинг вірусоносійства посівів зернових культур науково-дослідних господарств НУБіП України: ВП НУБіП України "Агрономічна дослідна станція", ВП НУБіП України "Великоснітинське НДГ ім. О. В. Музиченка", ВП НУБіП України "Великоснітинське НДГ ім. О. В. Музиченка" Гвардійський відділок.