Transcript mikronukleusz vizsgálat, egy

STTA
Ames mutagenitási vizsgálat
In vivo mikronukleusz
Tarnóczai Tímea
[email protected]
2012. 11. 27.
Mutációk



Mindig genetikai eredetű (környezeti vagy
endogén hatás)
Minél több mutáció jön létre, annál
nagyobb a rák kialakulásának
valószínűsége
Sok vegyi anyag kis dózisban mutagén,
nagy dózisban citotoxikus→genotoxikus
anyagok

Tautomerizáció
Mutagén tényezők




Fizikai tényezők: ionizáló és nem-ionizáló sugárzás
Ionizáló: rövid hullámhossz, atomokat ionokká
alakítja→vízből szabadgyökök keletkeznek→intenzív
oxidáció
Determinisztikus (küszöbdózis) és sztochasztikus
hatás (vagy kialakul, vagy nem, dózissal nő a
valószínűség)
Nem-ionizáló: hosszú hullámhossz (pl. UV, timin
dimerizáció)

kémiai tényezők:
 hatásmechanizmusok alapján lehetnek:
bázisanalógok
interkaláló vegyületek
(gyűrűs szerkezetű anyagok, beépülnek)
alkiláló vegyületek
deamináló vegyületek
szabadgyököt képező vegyületek
nehézfémek
DNS-szintézis inhibitorok
Bázisanalógok: A természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS
polimeráz beépíti a kettős spirálba
pl. 5-brómuracil (5BU) : timin analóg adeninnel és guaninnal is képes
párosodni, tranzíciót okoz

Deamináló szerek: indukált deaminációt okoz
pl. salétromossav
citozin→uracil, mely a következő replikáció során adeninnel
párosodik
és C-G > T-A tranzíciót okoz

Alkiláló szerek: alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak
bázisaira és azokat módosítják
pl.etil-metánszulfonát (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint
módosítja


a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez
a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre
Környezeti mutagén anyagok
élelmiszeradalékok:
nitritek,
nitrátok
nátriumbisziulfit
ciklohexamin
kozmetikumok:
hajfesték (nitrofenilén-diamin)
H2O2
femnilén-diamin
diaminotoluol
diaminoanizol
gyógyszerek:
citosztatikumok
altató és nyugtató szer
fertőtlenítőszerek (formaldehid, H2O2)
növényvédőszerek, herbicidek,
insecticidek:
klórozott szénhidrogének
szerves-foszforsav észterek
karbamidok, karbamátok,
ftálamidok, szerves higanyvegyületek
Vegyiparban használt köztes és
végtermékek:
epoxidok
etilén-iminek
acetaldehid
Akrilaldehid
propán szulfon
Dimetil-szulfát
Dietil-szulfát
dimetil-nitrózamin
hidrazinok
uretán
Etilén-klorid
Vinil-klorid
Levegőszennyezés:
policiklikus aromás szénhidrogének
Szervetlen mikroszennyezők:
nehézfémek
azbeszt
Szerves mikroszennyezők:
gomba és baktériumok által termelt toxinok
STTA (stable transfected
transcriptional activation assay)






Endokrin diszruptorok azonosítására
OECD 455 guideline
Hormonreceptorok citoplazmában
Szubsztrát kötődés
Dimerizáció és aktiválódás
Receptor-ligand komplex DNS promóterhez
kötődik→transzkripció aktiválása
STTA assay-ben:
 hERα-HeLa-9903 sejtvonal
 Legrégebbi humán sejtvonal
 Méhnyakrákból származik (Henrietta Lacks)
 HeLa genetikailag módosított változata→ ösztrogén
reszponzív elemek, ösztrogén receptor







DNS-ben szintetikus promóter kötőhellyel
Promóter után luciferáz gén→hormon hatású anyag kötődése esetén
átíródik
Szubsztrát (luciferin) hozzáadása
Fény szabadul fel, amit mérni lehet (luminométer)
Minél nagyobb a fény aktivitása, annál nagyobb a hormonreceptor hatás (1
μM határig)
Pozitív és negatív referencia anyagok (határokon belül!)
Pozitív és negatív kontroll
dimerizáció
ligandum
citoplazma
HR
sejtmag
Full length of hER
luciferáz
5’
hER
vegyület
5’
luciferáz
3’
fény
Luciferáz aktivitás
ERE
Luciferinluciferáz
reakcó
3’
ERE
HR: Hormon Receptor
hER: humán ösztrogén receptor
ERE:Estrogen-Responsive Element
0
10-12 10-11 10-10 10-9 M
Bakteriális reverz
mutagenitási vizsgálat







Bruce Ames 1970-es évek elején
Pontmutációt okozó kémiai anyagok észlelésére
alkalmas (genetikai betegségek)
Prokarióta sejtek
Aminosav szintetizáló képesség károsodott
Öröklött génmutáció reverziója
A kémiai anyag által okozott mutáció ezt a
képességet állítja vissza (back mutáció)
Minél több mutációt okoz egy anyag, annál
valószínűbb, hogy pont az a triplet mutálódik
Különbözik
az emlőssejtektől (metabolizmus,
kémiai anyagok felvétele, kromoszómaszerkezet)
Metabolikus aktivizálás kívülről
Citokróm P450 oxidációs rendszer (májban)
 S9 mikroszóma frakció + NADP + kofaktorok
Enzim termelődésének növelése→inducer
Nem mindig alkalmazható (baktericid vegyületek)
Spontán módon is visszafordulhat a mutáció
(spontán revertánsok-negatív kontroll)
Teszttörzsek





Escherichia coli és Salmonella typhimurium
E. coli triptofán mutáns (WP2 uvrA),
S. typhimurium hisztidin mutáns (TA98, TA100,
TA1535, TA1537)
Mutációk a hisztidin és triptofán operon
különböző részén (más-más törzsek)
Back mutáció hatására aminosav hiányában is
nőnek
Negatív és pozitív kontroll kell
Egyéb genetikai módosítások





Cél az érzékenység növelése
Rfa mutáció: nagy molekulasúlyú anyagok
bejutása
uvrA/uvrB mutáció: DNS javító mechanizmus
mutációja
pKM101 plazmid: Kémiai és UV-besugárzás
szembeni érzékenység növelése, ampicillin
rezisztencia
Törzsek ellenőrzése szükséges


Előinkubációs és lemezöntéses módszer
Speciális anyagoknál módosítások
A vizsgálat menete








10 órás szuszpenziós tenyészet készítése
Másnap kémcsőben tenyészet + puffer +
kontroll vegyület/teszt anyag + top agar
Minimál agaros Petri-csészére önteni
Top agar megszilárdulása
Inkubálás 48-72 óráig 37°C-on
Előinkubáció esetén top agar nélküli keverék
inkubálása (előinkubáció ideje 20-40 perc)
Telepszámolás, mikroszkópos értékelés
Eredmények értékelése (szignifikáns
emelkedés/statisztikai értékelés)
Aminosav igény ellenőrzése
(minimál agar)
Ampicillin rezisztencia,
kristályibolya- és UV-érzékenység
(tápagar)
Spontán mutáció (negatív kontroll)
Indukált mutáció (pozitív kontroll)
Negatív kontroll, normál
baktériumpázsit
25μg/lemez glutáraldehid
toxikus hatása
Ames II.





módosított Ames vizsgálat
96 v. 384 lyukú mikrotiter lemez
TA 98 (frameshift) és TAMix (6 törzs, bázispár szubsz.)
baktériumok és teszt anyag + hisztidin = savas közeg,
melyet a pH indikátor festék érzékel (lilából sárgába vált)
automatizált, kisebb mennyiség is elég
In vivo mikronukleusz



Genotoxikus károsodás vizsgálata eritrocitákon
Kromoszómakárosodás következtében kialakuló
mikronukleusz megléte
Mikronukleusz: membránnal határolt teljes kr. vagy kr.
darab
(a) a mikronukleusz
acentrikus kromoszóma
fragmensből származik
(b) a mikronukleusz
egész kromoszómát
tartalmaz


Emlős csontvelőben vagy perifériális vérben
OECD Guideline 474




A csontvelőben történik az vörösvérsejtek
érése
Normocita→polikromáziás eritrocita
fejlődés során a mag kipréselődik a
sejtből
Ha keletkezett mikronukleusz, azt az
polikromáziás eritrocitában láthatjuk
A mikronukleusszal rendelkező
eritrocitaszám emelkedés megemelkedett
kromoszómális károsodásra utal






Állatok kezelése subcutan (bőr alatt) vagy per os
(szájon át)
Kontroll (negatív és pozitív) és kezelt csoport
Megfelelő oldószer kiválasztása: ne legyen
toxikus, ne lépjen reakcióba a tesztanyaggal
Kezelés egyszer→leölés és csontvelő kivétele (24
és 48 órával a kezelés után)
Perifériális vérminta esetén vérvétel kétszer (36
és 72 órával a kezelés után)
Femur preparálás→csontvelő fötális
borjúsavóba→centrifugálás→kenetkészítés

Kenetkészítés után festés (May-Grünwald és Giemsa)
Normocita
Polikromáziás eritrocita mikronukleusszal
és anélkül
Egy polikromáziás eritrocita az érett
eritrociták között






Értékelés mikroszkóppal
Először polikromáziás eritrocita
(PCE)/normocita(NCE) arány
meghatározása (100 db PCE leszámolás)
2000 PCE közül mennyiben van
mikronukleusz
PCE/NCE arány 0,1 felett kell legyen
A vizsgálat végén az alább adatokra lesz
szükség: MPCE/2000 PCE, NCE/ 100 PCE,
PCE/NCE arány
Statisztikai értékelés