Transcript a bakteriális reverz mutációs vizsgálat

Genotoxicitás
Mutagén hatások
Ames mutagenitási vizsgálat
In vivo mikronukleusz
Tarnóczai Tímea
Országos Kémiai Biztonsági Intézet
2011. 11. 17.



A genotoxikológia az emberrel közvetlenül
kapcsolatba kerülő anyagok mutagén hatását
vizsgálja.
Genotoxikus anyagok a DNS-ben tárolt genetikai
információt örökletes módon megváltoztatják.
Mutáció: Egy tulajdonság egy nemzedéken
belül ugrásszerűen, és öröklődő módon
megváltozik.



Mutációk csoportosítása eredetük szerint:
 spontán mutáció: természetes körülmények közt minden fajra jellemző
gyakorisággal lép fel.
Prokariótáknál nagyobb, mint az eukariótáknál
pl. tautomerizáció, spontán deamináció
 indukált mutáció: környezeti hatásra létrejövő ill. kísérleti körülmények
között kiváltott mutációk.
Mutációk csoportosítása az érintett sejtvonal szerint:
 szomatikus
 germinális
Mutációk csoportosítás a hatópont szerint:
 gén- v. pontmutációk
 Tranzíció: purin-purin vagy pirimidin-pirimidin csere (A→G, G →A
vagy T→C, C →T)
 Transzverzió: purin-pirimidin vagy pirimidin-purin csere (A →T, A
→C, G →T, G →C vagy T →A, T →G, C →A, C →G)
 Inszerció, deléció: Egy vagy két bázis betoldása vagy kiesése
(olvasási keret megváltozása)
 kromoszóma mutációk
 Pontmutáció hatása a géntermékre:
csendes mutáció: A triplet utolsó bázisa változik, de ugyanazt kódolja.
AGT (Ser) → AGC (Ser)
semleges mutáció: A kódolt aminosav hasonló jellegűre változik, ezért a fehérje
szerkezetét és funkcióját nem feltétlenül érinti.
AAA (Lys bázikus) →AGA (Arg bázikus)
misszensz mutáció: Egy báziscsere miatt másik nem funkcióképes aminosav
kódja keletkezik. GAG (Glu savas)→GTG (Val semleges)
nonszensz mutáció: Egy báziscsere miatt STOP kód keletkezik.
TAC (Tyr) →TAG (Stop)
kereteltolódási mutáció (frameshift): Egy vagy két bázis kiesése vagy
hozzáadódása miatt elcsúszik a leolvasási keret.
A
Bázis tautomerizáció (spontán m.)
Guanin és timin keto formában
Adenin és citozin amino formában
A guanin enol formája timinnel, az
adenin imino formája pedig citozinnal
képes H-híd kialakítására.
A citozin imino formája adeninnel, a
timin enol formája pedig guaninnel
képes H-híd kialakítására.
A párosodási hiba a replikáció során
az újonnan szintetizált szálban
megmarad és állandósul
Mutagén tényezők


sugárzás (röntgen, ultraibolya, radioizotópok)
molekulákat gerjesztik és ionizálják, sejtben sok
vízmolekula→szabadgyökök
kémiai anyagok:
 hatásmechanizmusok alapján lehetnek:
bázisanalógok
interkaláló vegyületek
alkiláló vegyületek
deamináló vegyületek
szabadgyököt képező vegyületek
nehézfémek
DNS-szintézis inhibitorok


Bázisanalógok: A természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS
polimeráz beépíti a kettős spirálba
pl. 5-brómuracil (5BU) : timin analóg adeninnel és guaninnal is képes
párosodni, tranzíciót okoz
Deamináló szerek: indukált deaminációt okoz (aminocsoport→oxocsoport)
pl. salétromossav
citozin→uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik
és C-G > T-A tranzíciót okoz

Alkiláló szerek: alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak
bázisaira és azokat módosítják
pl.etil-metánszulfonát (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint
módosítja


a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez
a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre

Környezeti mutagén anyagok
élelmiszeradalékok:
nitritek
nitrátok
nátriumbisziulfit
ciklohexamin
kozmetikumok:
hajfesték (nitrofenilén-diamin)
H2O2
femnilén-diamin
diaminotoluol
diaminoanizol
gyógyszerek:
citosztatikumok
altató és nyugtató szer
fertőtlenítőszerek (formaldehid, H2O2)
növényvédőszerek, herbicidek,
insecticidek:
klórozott szénhidrogének
szerves-foszforsav észterek
karbamidok, karbamátok,
ftálamidok, szerves higanyvegyületek
Vegyiparban használt köztes és
végtermékek:
epoxidok
etilén-iminek
acetaldehid
akrilaldehid
Propán-szulfon
Dimetil-szulfát
Dietil-szulfát
dimetil-nitrózamin
hidrazinok
uretán
Etilén-klorid
Vinil-klorid
Levegőszennyezés:
policiklikus aromás szénhidrogének
Szervetlen mikroszennyezők:
nehézfémek
azbeszt
Szerves mikroszennyezők:
gomba és baktériumok által termelt
toxinok
Bakteriális reverz
mutagenitási vizsgálat







Bruce Ames 1970-es évek elején
Pontmutációt okozó kémiai anyagok észlelésére alkalmas
Daganatos betegségek, fertilitási problémák, genetikai
betegségek (pl. albinizmus)
Mutáns prokarióta sejtek (Escherichia coli és Salmonella
typhimurium)
Aminosav szintetizáló képesség károsodott
A kémiai anyag által okozott mutáció ezt a képességet
állítja vissza (back mutáció vagy reverzió)
Spontán módon is visszafordulhat a mutáció (spontán
revertánsok-negatív kontroll)
Különbözik
az emlőssejtektől (metabolizmus,
kémiai anyagok felvétele, kromoszómaszerkezet)
Metabolikus aktivizálás kívülről
Citokróm P450 metabolikus oxidációs rendszer
Kísérleti állatok kezelése
 Enzim termelődésének növelése→inducer
S9 mikroszóma frakció + NADP + kofaktorok
Nem mindig alkalmazható (baktericid vegyületek)
Előinkubációs és lemezöntéses módszer
Speciális anyagoknál módosítások
Teszttörzsek





E. coli triptofán mutáns (WP2 uvrA),
S. typhimurium hisztidin mutáns (TA98, TA100,
TA1535, TA1537)
Mutációk a hisztidin és triptofán operon
különböző részén (más-más törzsek)
Hisztidin és triptofán mentes táptalajon
inkubálás
Back mutáció hatására aminosav hiányában is
nőnek
Negatív és pozitív kontroll kell
Egyéb genetikai módosítások





Cél az érzékenység növelése
Rfa mutáció: nagy molekulasúlyú anyagok
bejutása (ellenőrzés kristályibolyával)
uvrA/uvrB mutáció: DNS javító mechanizmus
mutációja
pKM101 plazmid: Kémiai és UV-besugárzás
szembeni érzékenység növelése, ampicillin
rezisztencia
Törzsek ellenőrzése szükséges
Alkalmazott törzsek genotípusa
Törzs
Mutáció génje
Mutáció típusa
DNS-repair
LPS
Plazmid
TA98
hisD
Frameshift
uvrB
rfa
pKM101
TA100
hisG
Bázispár
szubsztitúció
uvrB
rfa
pKM101
TA1535
hisG
Bázispár
szubsztitúció
uvrB
rfa
-
TA1537
hisC
Frameshift
uvrB
rfa
-
WP2 uvrA
trp
Bázispár
szubsztitúció
uvrA
-
-
Alkalmazott törzsek fenotípusa
TA98
TA100
TA1535
TA1537
WP2 uvrA
Hisztidin
szükséglet
+
+
+
+
-
Triptofán
szükséglet
-
-
-
-
+
Kristályibolya
érzékenység
++
++
++
++
+
UV érzékenység
+
+
++
++
++
Ampicillin
rezisztencia
+
+
-
-
-
Spontán
revertánsok
20-50
75-200
5-20
5-20
8-50
A vizsgálat menete








10 órás szuszpenziós tenyészet készítése
Másnap kémcsőben tenyészet + puffer +
kontroll vegyület/teszt anyag + top agar
Minimál agaros Petri-csészére önteni
Top agar megszilárdulása
Inkubálás 48-72 óráig 37°C-on
Előinkubáció esetén top agar nélküli keverék
inkubálása (előinkubáció ideje 20-40 perc)
Telepszámolás, mikroszkópos értékelés
Eredmények értékelése (szignifikáns
emelkedés/statisztikai értékelés)
(Mutagén anyag vizsgálata)
Aminosav igény ellenőrzése
(minimál agar)
Spontán mutáció (negatív kontroll)
Ampicillin rezisztencia,
kristályibolya- és UV-érzékenység
(tápagar)
Indukált mutáció (pozitív kontroll)
A fényképek az OKBI MSBO laboratóriumában készültek 2011-ben.
Negatív kontroll, normál
baktériumpázsit
25μg/lemez glutáraldehid
toxikus hatása
A fényképek az OKBI MSBO laboratóriumában készültek 2011-ben.
Ames II.





módosított Ames vizsgálat
96 v. 384 lyukú mikrotiter lemez
TA 98 (frameshift) és TAMix (6 törzs, bázispár szubsz.)
baktériumok + teszt anyag + hisztidin = savas közeg,
melyet a pH indikátor festék érzékel (lilából sárgába vált)
automatizált, kisebb mennyiség is elég
In vivo mikronukleusz



Genotoxikus károsodás vizsgálata eritrocitákon
Kromoszómakárosodás következtében kialakuló
mikronukleusz megléte
Mikronukleusz: membránnal határolt teljes kr. vagy kr.
darab
(a) a mikronukleusz
acentrikus kromoszóma
fragmensből származik
(b) a mikronukleusz egész
kromoszómát tartalmaz


Emlős csontvelőben vagy perifériális vérben
OECD Guideline 474




A csontvelőben történik az vörösvérsejtek
érése
Normoblast→polikromáziás eritrocita
fejlődés során a mag kipréselődik a
sejtből
Ha keletkezett mikronukleusz, azt az
polikromáziás eritrocitában láthatjuk
A mikronukleusszal rendelkező
polikromáziás eritrocitaszám emelkedés
megemelkedett kromoszómális
károsodásra utal






Állatok kezelése intraperitoneálisan vagy per os
(szájon át)
Kontroll (negatív és pozitív) és kezelt csoport
(több dózis, hím és nőstény állatok)
Megfelelő oldószer kiválasztása: ne legyen
toxikus, ne lépjen reakcióba a tesztanyaggal
Kezelés egyszer→leölés és csontvelő kivétele (24
és 48 órával a kezelés után)
Perifériális vérminta esetén vérvétel kétszer (36
és 72 órával a kezelés után)
Femur preparálás→csontvelő fötális
borjúsavóba→centrifugálás→kenetkészítés

Kenetkészítés után festés (May-Grünwald és Giemsa)
Egy polikromáziás eritrocita az érett
eritrociták (normociták) között
Polikromáziás eritrocita mikronukleusszal
és anélkül






Értékelés mikroszkóppal
Először polikromáziás eritrocita
(PCE)/normocita(NCE) arány
meghatározása (100 db PCE leszámolás)
2000 PCE közül mennyiben van
mikronukleusz
PCE/NCE arány 0,1 felett kell legyen
A vizsgálat végén az alább adatokra lesz
szükség: MPCE/2000 PCE, NCE/ 100 PCE,
PCE/NCE arány
Statisztikai értékelés