Transcript Tipizacija HLA mogućih primatelja i darivatelja organa kod

TIPIZACIJA HLA MOGUĆIH
PRIMATELJA I DARIVATELJA
ORGANA KOD TRANSPLANTACIJE
SOLIDNIH ORGANA
Sanja Salamunović, dipl.ing.med.lab.diag.
KLINIČKA JEDINICA ZA TIPIZACIJU TKIVA
KLINIČKI ZAVOD ZA TRANSFUZIJSKU MEDICINU I TRANSPLANTACIJSKU BIOLOGIJU
KBC-ZAGREB
Zadar, 23.rujan 2011.
TRANSPLANTACIJA?
 Unošenje stranog tkiva - organa davatelja u organizam primatelja u
svrhu liječenja
 Prema vrsti transplantata razlikujemo:
Transplantaciju nelimfatičnog tkiva (solidnih organa):
 Bubreg, srce, jetra, gušterača, pluća, rožnica
Transplantaciju limfatičnog tkiva:
 Koštana srž, krvotvorna matične stanice
MALO POVIJESTI...
KBC-RIJEKA
 1971. Prva transplantacija bubrega sa živog
darivatelja
 1972. Prva transplantacija bubrega sa umrle osobe
Prof.dr.Vinko Frančišković i sur.
 1971. Prva tipizacija antigena HLA
Prof.dr.Ksenija Vujaklija - Stipanović
KBC-ZAGREB
 1988. Prva transplantacija srca
Prof.dr.Josip Sokolić i sur.
KBC – ZAGREB
 1990. Prva transplantacija jetre
Doc.dr.sc.Vuk Borčić i sur.
....I JOŠ MALO
KB JORDANOVAC,
2002. Prva transplantacija pluća
Prof.dr.sc.Zoran Slobodnjak i sur.
KBC- RIJEKA
1993. Prva simultana transplantacija
bubrega i gušterače
Prof.dr.sc. Miomir Zelić i sur.
KB – MERKUR
2002. – Prva,simultana transplantacija
jetre i bubrega
Prof.dr.sc.Josip Pasini
Dr.Stipe Jandrijević i sur.
TRANSPLANTACIJA ORGANA U RH
26.05.2007.
RH PUNOPRAVNA ČLANICA
EUROTRANSPLANTA
EFI AKREDITIRANI LABORATORIJI
U RH
UVJET ZA PRIHVAĆANJE LABORATORIJA U ET PROGRAM:
 AKREDITACIJA
EVROPSKE FEDERACIJE ZA IMUNOGENETIKU
(EFI AKREDITACIJA)
ZAGREB ( 22.05.2007.)
KJ za tipizaciju tkiva, Klinički zavod za transfuzijsku medicinu i
transplantacijsku biologiju, KBC Zagreb

Referentni centar MZSS za tipizaciju tkiva
RIJEKA ( 12.09.2008.)
KJ za tipizaciju tkiva, Klinički zavod za transfuzijsku medicinu, KBC
Rijeka
EFI AKREDITACIJA
EUROTRANSPLANT ?
 Najveća europska organizacija za
transplantaciju organa
 Obuhvaća regiju u kojoj živi 120 000 000
stanovnika
 7 zemalja članica
 Belgija, Njemačka, Hrvatska,
Luksemburg,Nizozemska, Austrija i Slovenija
EUROTRANSPLANT ?
 Središte u Leidenu - Nizozemska
 Povezuje transplantacijske centre, laboratorije i donorske bolnice u
zemljama članicama
 Povezujući donorski organ s primateljem ostvaruje se cilj optimalno iskorištenje doniranih organa
 Na središnjoj listi čekanja Eurotransplanta prijavljeno je oko 16 000
mogućih primatelja organa
 Liste čekanja podijeljene su po organima (bubreg, srce, jetra, pluća)
EUROTRANSPLANT - PREDNOSTI

Postojanje jedinstvenog donorskog identifikacijskog sustava

Velik broj donorskih organa (godišnje oko 7000)

Postojanje jedinstvene liste čekanja ( za svaki organ posebno )

Velik broj prijavljenih primatelja daje mogućnost odabira
najpodudarnijeg donorskog organa

Povećavanje šanse hitnog dobivanja organa živitno ugroženim
pacijentima

Udruženi stručnjaci svih članica izrađuju i
poboljšavaju propise za raspodjelu (ALOKACIJU) donorskih organa
RASPODJELA ORGANA U
EUROTRANSPLANTU
Raspodjela organa se temelji na medicinskim i etičkim
načelima vodeći računa o :









Krvnoj grupi
HLA podudarnosti između darivatelja i primatelja
Postotku senzibilizacije antitjelima HLA
Vremenu provedenom na listi čekanja
Dobi pacijenta, ako se radi o djeci
Životnoj ugroženosti
Nacionalnoj uravnoteženosti primatelja i darivatelja organa
Svaki od navedenih parametara donosi određen broj bodova
Najveći broj bodova donosi upravo HLA podudarnost
CILJ DOBRE PODUDARNOSTI HLA
Imunološki predtransplantacijski cilj je
 spriječiti odbacivanje transplantata
 Bolja podudarnost u alelima HLA – duže
preživljavanje transplantata
Manja nepodudarnost – duže
preživljavanje transplantata
ODREĐIVANJE HLA PODUDARNOSTI
PRIMATELJA I DAVATELJA
Imunogenetski test
HLA TIPIZACIJA
To je određivanje polimorfizma alela HLA
laboratorijskim testovima
SUSTAV HLA
Glavni sustav tkivne snošljivosti kod ljudi nazvan
 Human Lekocitni Antigeni ( HLA )
 Središnji dio svih imunoloških reakcija - sudjeluje u imunološkim
zbivanjima prerade i predočavanja antigena limfocitima T
 Sustav čine blisko vezani geni smješteni na kraćem kraku
kromosoma 6
 Obuhvaća ~ 0,1% ljudskog genoma (~4.000.000 pb)
 To je najpolimorfniji genetski sustav u čovjeka
 Poznato više od 3500 alela HLA razreda I i razreda II
PODJELA GENA SUSTAVA HLA
Geni sustava HLA su podijeljeni na
 RAZRED I
 RAZRED II
Unutar razreda geni su podijeljeni na lokuse

RAZRED I (lokus A, B,C)
 RAZRED II (lokus DR,DQ,DP)
ZNAČAJ ODREĐIVANJA GENA HLA
presađivanja tkiva i organa
povezanost s bolestima
antropološka istraživanja
sudska medicina
TIPIZACIJA TKIVA
ODREĐIVANJE GENA HLA LABORATORIJSKIM TESTOVIMA
NA SVAKOM LOKUSU TIPIZACIJOM TKIVA ODREĐUJU SE DVA ALELA
JEDAN NASLIJEĐEN
OD OCA
DR3
B8
JEDAN NASLIJEĐEN
OD MAJKE
A1
DR4
B7
A3
REZULTAT HLA TIPIZACIJE
HLA - A1, A3
B7, B8
DR3, DR4
TIPIZACIJA HLA PRIMATELJA
ORGANA




Metoda izbora – molekularna ( DNA) tipizacija
Uvjet za prijavljivanje na listu čekanja
Obavezno određivanje alela HLA -A, -B, -DR
Preporučljivo i određivanje HLA -C, -DQ
 Primatelji bubrega se tipiziraju iz dva neovisno izvađena uzorka
venske krvi ( s antikoagulansom EDTA )
 Prvi uzorak se tipizira metodom PCR-SSP
 Drugi uzorak se tipizira metodom PCR-SSO
 Dvije tipizacije svakog primatelja bubrega moraju biti identične
 Primatelji srca, jetre, pluća se tipiziraju jednokratno metodom
PCR-SSO
 Nakon uspješne tipizacije primatelji se prijavljuju na ET liste
čekanja
DARIVATELJI ORGANA
 Svaka umrla osoba kod koje je nastupila cerebralna smrt ( trajni
prestanak svih moždanih funkcija) – KADAVERIČNI DARIVATELJ
 Darivatelj može biti i živa osoba ( bubreg, dio jetre itd.)
 U RH je zakonom propisan protokol utvrđivanja moždane smrti
 Zakon o pretpostavljenom pristanku
 Pristanak obitelji
Tipizacija HLA darivatelja organa
 Transplantacijski koordinatori (zemalja članica ET)
prijavljuju ET-u postojanje darivatelja organa u svojoj zemlji
 Transplantacijski koordinatori Ministarstva zdravstva i socijalne skrbi RH
kontaktiraju pripravnog djelatnika za tipizaciju tkiva ( Zagreb, Rijeka )
 Pristupa se tipizaciji darivatelja - po hitnom postupku
 Molekularna tipizacija gena HLA izvodi se metodom PCR-SSP
 Iz uzorka venske krvi uzete sa antiloagulansom EDTA
 Koriste se dva paralelna testa ( različitih proizvođača) za lokuse HLA -A, -B,
-C ,-DR i – DQ (Olerup, Innvitrogen)
 Vrijeme izvođenja tipizacije gena HLA je 5 – 6 sati
 Izvješće sa tipizacijom donora se šalje u dežurni centar ET
IZOLACIJA DNA
 Venska krv sa EDTA kao antikoagulansom
 Izolacija DNA - komercijalni set za brzu izolaciju DNA pomoću
kolumni (Nucleospin@Blood)
 Enzim proteinaza K, uz pomoć pufera, razara proteinske strukture
staničnih membrana
 DNA izlazi iz jezgre i veže se za silikonsku membranu kolumne
 Metoda brza, jednostavna
PCR- SSP
 PCR (engl. polymerase chein reaktion)
 SSP (engl. sequence specific primers )
 Enzimatsko umnažanje dijela DNA
molekule uz pomoć specifičnih primera za alel ili grupu alela
 Mala količina materijala
 Velika količina umnožene DNA
 Kratko vrijeme izvođenja testa
PCR - SSP
 Molekularna tipizacija lokusa na komercijalnim testovima
 HLA-A*
24 reakcije
 HLA-B*
48 reakcija
 HLA-C*
24 reakcije
 HLA-DRB1* 24 reakcije
 HLA-DQB1*
8 reakcija
 Za darivatelje organa izvodi se paralelno na dva testa različitog
proizvođača ( Olerup, Innvitrogen )
 Za primatelje organa ova metoda se primjenjuje za tipizaciju prvog
uzorka MPB
SET ZA MOLEKULARNU
TIPIZACIJU HLA – SSP( Olerup )
VIZUALIZACIJA REZULTATA
Elektroforeza
 Uzorci se nanose na 1,5% agarozni gel, kroz koji protiče istosmjerna struja
 Nukleinske kiseline su negativno nabijene te u električnom polju putuju
prema pozitivnom polu
 Dolazi do razdvajanja fragmenata jer manji fragmenti putuju brže od većih
 DNK se boji etidium bromidom koji se umeće između parova baza DNK
 Razdvojeni fragmenti pobuđeni UV svjetlom narančasto fluoresciraju
DETEKCIJA REZULTATA
 Test se očitava kao niz pozitivnih i negativnih reakcija
 Svaki gel je fotografiran kamerom (G:Box Synergine)
 Analiza uz pomoć kompjuterskog programa
 Run Score (Olerup)
 UniMatsch 4,0 (Innvitrogen)
 Pozitivna reakcija – vidljive su dvije vrpce: jedna kontrolnih početnica, a druga
alel specifičnog produkta –
 na nekim reakcijama uz produkt kontrolnih početnica su prisutni i alel specifični
produkti
 Negativna reakcija – vidljiva je jedna vrpca koja je produkt kontrolnih početnica
 prisutan je samo produkt kontrolnih početnica
KOMPJUTERSKA ANALIZA
( RUN SCORE – Olerup )
•
NALAZ HLA TIPIZACIJE
PRIJAVA TIPIZACIJE
PRIMATELJA U ET
PRIJAVA TIPIZACIJE DAVATELJA ET OBRAZAC
Alokacijska lista
Lista čekanja
HVALA NA PAŽNJI !