Transcript Диплоидные фибробласты - Кафедра цитологии и генетики

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ И
МОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК, ФИБРОБЛАСТОВ
РАЗЛИЧНОЙ ПЛОИДНОСТИ И СТАБИЛЬНЫХ
ГИБРИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИХ СЛИЯНИЕМ
Короткевич Екатерина Юрьевна
Новосибирский государственный университет
Научный руководитель: к.б.н., в.н.с. Киселева Е.В.
Институт цитологии и генетики СО РАН
2010 г.
Цель: выявить особенности структурной организации гибридных
клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых и
дифференцированных клеток мыши, а также сравнить строение
плюрипотентных клеток мыши в условиях in vivo и in vitro.
Задачи:
1. Провести морфологический анализ эмбриональных стволовых клеток линии
E14Tg2aSc4TP6.3, полученной из мышей 129/Ola Mus musculus, и сравнить их с
клетками предимплантационных эмбрионов (от зиготы до бластоцисты) для
оценки влияния культивирования на ультраструктуру клеток ВКМ.
2. Изучить морфологию ди- и тетраплоидных фибробластов мыши линии DD/c и
сравнить их структурную организацию.
3. Сравнить ультраструктуру двух типов стабильных гибридов, полученных в
результате слияния ЭСК и ди- или тетраплоидных фибробластов мыши, с
родительскими клетками для выявления особенностей реорганизации клеток
при взаимодействии геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток.
4. Провести сравнительный морфометрический анализ ядерноцитоплазматического отношения и поверхностно-объемного отношения ядер в
плюрипотентных, дифференцированных и гибридных клетках для получения
количественной информации об организации клеток с различной степенью
дифференцировки.
ДФМ
ВКМ
...
Зигота
..?..
ЭСК
Бластоциста
ТФМ
ЭСК-подобный
гибрид
Фибробластоподобный
гибрид
4.
Провести
Изучить сравнительный
морфологию диморфометрический
ианализ
тетраплоидных
фибробластов
анализ
ядерно-мыши
1.2.
3.
Провести
Сравнить
морфологический
ультраструктуру
двух
типов
эмбриональных
стабильных
гибридов,
стволовых
клеток
цитоплазматического
линииE14Tg2aSc4TP6.3,
DD/cвирезультате
сравнить
отношения
их
структурную
и ЭСК
поверхностно-объемного
линии
полученных
слияния
полученной
изи организацию.
мышей
ди- или 129/Ola
тетраплоидных
Mus musculus, и
отношения
ядер
в
плюрипотентных,
дифференцированных
и зиготы до
сравнить их с клетками
фибробластов
мыши, с родительскими
предимплантационных
клетками
эмбрионов
с целью выявления
(от
гибридных
клетках
для получения
количественной
информации
об
бластоцисты)
особенностей
для
реорганизации
оценки
влияния
клеток
культивирования
при взаимодействии
на строение
геномов
клеток
организации
клеток
с различной степенью клеток.
дифференцировки.
ВКМ.
плюрипотентной
и дифференцированной
Материалы и методы
Клеточные культуры и ранние эмбрионы мыши:
ЭСК – эмбриональные стволовые клетки (линия E14Tg2aSc4TP6.3,
получена из мышей 129/Ola Mus musculus) (Pratt, 2000);
ДФМ – диплоидные эмбриональные фибробласты (получены из 12.5дневных эмбрионов мышей линии DD/c Mus musculus);
tDD – тетраплоидные фибробласты (получены из ДФМ);
tef4 – стабильные гибридные клетки (17 пассажей), полученные при
слиянии ЭСК и ДФМ (Круглова, 2008);
tef-t8 – стабильные гибридные клетки (28 пассажей), полученные при
слиянии ЭСК и ТФМ (Круглова, 2008);
эмбрионы – получены из мышей линии 129/Ola (стадия зиготы, 2-х и 4-х
клеточного зародыша, морулы, блатоцисты).
Используемые в работе клеточные культуры и эмбрионы были любезно
предоставлены сотрудниками лаборатории генетики развития ИЦиГ СО РАН
к.б.н., н.с. А.А. Кругловой и к.б.н., с.н.с. Е.А. Кизиловой, соответственно.
Методы исследования:
-Световая микроскопия полутонких срезов
-Просвечивающая электронная микроскопия
-Морфометрический анализ
Особенности организации
эмбриональных стволовых клеток
А
В
Яд
Я
М
Яд
10 мкм
Б
Я
М
50 мкм
Световая микроскопия
Окраска метиленовым синим
2 мкм
Электронная микроскопия
Особенности ультраструктурной организации
митохондрий в эмбриональных стволовых клетках
А
Б
М
Я
М
М
М
В
Впервые обнаружено, что
ЭСК могут отличаться по
морфологии митохондрий.
В цитоплазме одних клеток
присутствуют митохондрии
со светлым матриксом и
узкими кристами (Рис. А), в
то время как цитоплазма
других клеток содержит
митохондрии с темным
матриксом и
расширенными кристами
(Рис. Б). Наряду с этим
встречаются клетки, в
которых присутствуют оба
типа митохондрий (Рис. В).
М
М
ЭПР
Масштаб 1 мкм
Стадии раннего
эмбрионального развития мыши
Зигота
Д
2-кл
р
о
б
л е
4-кл
н
и
е
Морула
Бластоциста
20 мкм
1 мкм
Сравнительный морфологический анализ ЭСК и клеток
внутренней клеточной массы бластоцисты
Яд
Я
Яд
Я
М
М
5 мкм
5 мкм
К
М
М
М
Ф
ЭПР
Л
ЭПР
М
1 мкм
Фрагменты ЭСК
Ф
Фрагменты клеток ВКМ
1 мкм
Сравнительный морфологический анализ ЭСК, диплоидных фибробластов
(ДФМ) и тетраплоидных фибробластов мыши (ТФМ), а также стабильных
гибридов, полученных в результате слияния ЭСК с ДФМ, ЭСК с ТФМ.
Диплоидные фибробласты:
Вытянутая форма, сглаженная ядерная
оболочка, высокая плотность органелл в
цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР,
микрофиламенты под плазмолеммой
ЭСК-подобные гибриды:
округлая форма, крупное ядро,
высокая изрезанность ядерной
оболочки, низкая плотность
органелл в цитоплазме, узкие
цистерны ЭПР
Эмбриональные
стволовые клетки:
округлая форма, крупное слегка
изрезанное
ядро,
низкая
плотность
органелл
в
цитоплазме, узкие цистерны
ЭПР
Тетраплоидные фибробласты:
вытянутая форма, сглаженная ядерная
оболочка, высокая плотность органелл в
цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР,
микрофиламенты под плазмалеммой
Фибробластоподобные гибриды:
вытянутая
форма,
глубокие
узкие
инвагинации ядерной оболочки, высокая
плотность
органелл
в
цитоплазме,
расширенные
цистерны
ЭПР,
микрофиламенты под плазмалеммой
Масштаб 20 мкм
Особенности ультраструктурной организации
фибробластов мыши в культуре
ЭПР
М
М
Яд
Я
0,5 мкм
ЭПР
5 мкм
0,5 мкм
Сравнительный морфологический анализ ЭСК и
гибридов, полученных слиянием ЭСК с диплоидными
фибробластами
М
Я
Яд
Я
Яд
Эмбриональная стволовая клетка
ЭСК-подобный гибрид
Масштаб 5 мкм
Сравнительный морфологический анализ
фибробластов и гибридов, полученных слиянием
ЭСК с тетраплоидными фибробластами
29 %
Я
Яд
Я
Фрагмент фибробласта
Фрагмент фибробласто-подобного
гибрида
Масштаб 5 мкм
Морфометрический анализ ядерноцитоплазматического соотношения
в гибридных и исходных клетках
Ядерно-цитоплазматическое отношение –
отношение площади ядра к площади всей клетки
на срезе, проходящем через середину ядра.
*
ESC
tef4 DFM TFM tef-t8
Средняя площадь ядра на
срезе
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
*
ESC
tef4 DFM TFM tef-t8
Средняя площадь клетки на
срезе
Ядерно-цитоплазматический индекс
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Площадь клетки, мкм2
Площадь ядра, мкм2
Анализ клеток на полутонких срезах
проводился с использованием
программы AxioVision.
0.7
0.6
0.5
0.4
*
0.3
0.2
0.1
0
ESC
tef4 DFM TFM tef-t8
Ядерно-цитоплазматические
отношения
*
Поверхностно-объемное отношение, мкм2/мкм3
Поверхностно-объемное отношение, мкм2/мкм3
Морфометрический анализ поверхностно-объемного
отношения ядер гибридных и исходных клеток
*
Поверхностно-объемное отношение (отношение площади поверхности ядра к
его объему) оценивали с помощью тестовой системы линий (открытая
квадратная решетка), накладываемой случайным образом на срез клетки,
проходящий через середину ядра (Груздев, А.Д.; Weible, E.R., 1969)
Выводы
1.ЭСК существенно отличаются от клеток ВКМ бластоцисты по строению
эндоплазматического ретикулума, отсутствию гранулярных и кристаллических
включений, пучков фибрилл в цитоплазме и типу межклеточных контактов.
В длительно культивируемых ЭКС мыши впервые обнаружен новый тип
митохондрий, который не похож ни на один из многочисленных видов
гетерогенной по морфологии популяции митохондрий ВКМ.
2.Тетраплоидные фибробласты сходны по ультраструктурной организации
с диплоидными фибробластами и отличается от них несколько большими
размерами клетки и ядра.
3.Гибридные клетки, полученные при слиянии ЭСК и диплоидных
фибробластов, имеют сходную структурную организацию с ЭСК, тогда
как гибридные клетки, полученные слиянием ЭСК и тетраплоидных
фибробластов, сходны по морфологии с фибробластами. Оба типа
гибридов характеризуются более высокой по сравнению с исходными
родительскими клетками изрезанностью ядерной оболочки, к внутренней
мембране которой прикрепляется компактный гетерохроматин.
4.Сходство гибридных клеток по морфологическим и морфометрическим
параметрам с ЭСК либо фибробластами скорее обусловлено
плоидностью соматического партнера.