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菜花、肝脏DNA的提取及琼
脂糖凝胶检测
一. 实验目的
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学习DNA提取的原理及方法。
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掌握琼脂糖凝胶电泳的操作方法。
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运用琼脂糖凝胶电泳检测DNA。
二 .实验原理
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1．核酸分离提取的原则
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1）应保证核酸一级结构的完整性
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2）排除其他分子的污染
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A． 核酸样品中不应存在对其有抑制作用的有机溶
剂和过高浓度的金属离子
B．其他生物大分子如：蛋白质，多糖和脂类分子
的污染应降低到最低程度
排除其他核酸分子的污染（如：提取DNA分子
应除去RNA；反之亦然）
2. 核酸提取的步骤
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1）破碎细胞（材料不同，方法不同）
匀浆器，捣碎器，溶菌酶消化，碱裂解等。
2） 除杂质，提DNA
杂质：蛋白，多糖，脂类，DNase, RNase

A. DNase的抑制
DNase需Mg2+,Ca2+激活，所以提取时加EDTA或EDTA
钠盐。（螯合金属离子）
加去垢剂或变性剂（SDS），可使DNase变性失活
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
B. 除RNA
酶法：加RNase
调节pH：RNA能在室温条件下被稀碱水解成核甘酸而
DNA对碱较稳定，所以提DNA一般要在偏碱的环境中提
取，提RNA要在偏酸的环境中稳定。如提植物DNA一般
要加Tris-酚（pH＝8.0），提RNA加水饱和酚（酸酚）
（pH＝5.8）。
调节盐浓度(盐的分步沉淀)：在浓NaCl（1－2M）溶液
中，DNA溶解度大，RNA溶解度小；在稀NaCl（0.14M）
中，DNA溶解度小，RNA溶解度大，因此可利用不同浓
度的NaCl溶液将DNA和RNA从样品中分开。
C. 除蛋白
加去垢剂或变性剂（SDS，十二烷基硫酸锂LDS，十
二烷基肌酸钠，脱氧胆酸钠）使蛋白变性，与DNA分
开；
用有机溶剂沉淀，除去蛋白
常用的有机溶剂：苯酚，氯仿，异丙醇，醚等
本次实验所用：氯仿：异丙醇＝24：1
氯仿：使有机相和水相易分层，增加核酸得率，
同时可除去脂类。
异丙醇：可减少泡沫，也能促使有机相，水相分
离。
加蛋白水解酶：如提动物组织中的DNA，常加蛋白酶
K
D. 除糖，脂类
对于含糖量高，含脂高的样品需要做
3.DNA提取注意事项
减少物理因素对DNA的降解。动作轻柔缓慢，尽可能
不要剧烈振荡或搅拌，除破碎细胞，使DNA和蛋白分
开时60－70℃水浴外，其余操作尽可能在冰浴上进行。
用枪吸核酸时最好用1ml的枪和枪头，枪头必要时可
用剪刀剪去一段，防止枪头对DNA造成机械损伤。
三.实验试剂
1，5mol/L NaC溶液;
2， 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA-Na溶液;
3，25% SDS 溶液；
4，24:1 氯仿－异戊醇混合液；
5，3mol/L 乙酸钠－0.001mol/L EDTA-Na溶液；
6，95%乙醇；
7，10 X TBE;
8，EB（溴乙啶）;
9，溴酚蓝指示剂
四.
实验步骤
（一）DNA提取
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1，称取 肝脏或者菜花5g,用水清洗后，加入石英砂(半匙)研
磨,再加入14ml 0.14M NaCl-0.15M EDTA溶液，继续研磨至
浆状，分装两管，平衡后对角线放入离心机，4000 rpm离心
10 min，所得沉淀即为核糖核酸粗制品．
2，上述沉淀物加入0.14M NaCl-0.15M EDTA溶液６ml，再
加入25% SDS 0.6 ml（分开两管），60℃保温10 min（不停
搅拌）．至溶液变粘稠。
3，上述溶液倒入研钵中，加入５Ｍ NaCl溶液３ml，搅拌10
min ，再加入氯仿－异戊醇10 ml，轻轻搅动15 min，分装两
管， 4000 rpm离心10 min， 取上清液(注意：不要取到中间
的蛋白质和下层的有机相）。
4，上清液加入1ml乙酸钠-EDTA溶液，加入1.5倍体积的
95%冰冻乙醇，用玻棒慢慢搅拌，可看见DNA缠绕在玻棒
上．
5，加100ul-200ul水溶解DNA。
（二） 琼脂糖凝胶法检测DNA
1. 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物。其结构单
元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链
依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖
束，构成大网孔型凝胶。在一定浓度的琼脂糖凝胶介
质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对
数成反比。
2. 溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，
EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激
发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加
入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将
凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂糖凝
胶EB染色，则肉眼可见核酸电泳带 .
2.设备与试剂
琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可
制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，
故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用
的有TBE（0.08mol/l Tris·HCl，pH8.5，0.08mol/L
硼酸，0.0024mol/l EDTA）
3.凝胶制备
用上述缓冲液配制1%琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波
炉加热使之融化，冷至55℃时加入溴化乙锭（EB）至终
浓度为0.5μg/ml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板
组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿
下端距玻璃板0.5-1.0mm，待胶凝固后，取出梳子，加
入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。
4.样品制备与加样
5ul的样品中加入5ul上样缓冲液：含指示染料（0.025％溴
酚蓝或桔黄橙）、蔗糖（10％-15％）或甘油（5％-10
％），也可使用2.5％Fico Ⅱ增加比重，使样品集中，每齿
孔可加样10ul(5-10ug)
5. 电泳
一般电压为5-15V/cm ,根据指示剂泳动的位置，判断是
否终止电泳 (本次实验用100V，70mA，20－40min)
提取完好的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱
未除去RNA的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱
五.实验结果
六、实验结果分析讨论
七、思考题
1，写出本次实验中提取DNA时每一步操作中
所用试剂的目的。
2，查阅相关资料，写出至少一种其它方法提
取DNA的原理及步骤