Transcript zabicka
Metody detekcji i identyfikacji
bakterii
Dorota Żabicka
Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej
Narodowy Instytut Leków Warszawa
Budowa komórki bakteryjnej
Badanie mikrobiologiczne
Cel:
identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia
i oznaczenie wrażliwości na antybiotyki
Tok badania mikrobiologicznego
Pobranie materiału
Badanie materiału:
Metody klasyczne
Badanie mikroskopowe
Hodowla i identyfikacja drobnoustroju
Oznaczenie wrażliwości bakterii na antybiotyki
Metody immunologiczne
Metody molekularne
Pobieranie i przesyłanie
materiału
Rodzaj podłoża transportowego
i rodzaj pojemników są
dostosowywane do rodzaju
materiału i kierunku badania
(bakterie, wirusy, obecność
przeciwciał)
Badanie mikroskopowe
Mikroskop świetlny
Preparaty barwione
metoda Grama
metody specjalne np.
barwienie na obecność
zarodników
Laseczka tężca
Clostridium tetani,
zarodniki na końcu
komórki bakteryjnej
nadające kształt
pałeczki dobosza
Ściana komórkowa bakterii
Bakterie Gram-dodatnie
Bakterie Gram-ujemne
Badanie mikroskopowe
Neisseria meningitidis
Preparat z osadu płynu mózgowordzeniowego barwiony metodą Grama
Cryptococcus neoformans
Preparat tuszowy z osadu płynu
mózgowo-rdzeniowego
Badanie mikroskopowe
Preparat z ciemnym
polem widzenia
(Treponema pallidum)
Mikroskop
fluorescencyjny
Badanie mikroskopowe
Mikroskop kontrastowo-fazowy
grzyby z rodzaju Candida
Badanie mikroskopowe
Mikroskop elektronowy
Hodowla bakterii
Stosowane podłoża bakteriologiczne płynne i
stałe
Hodowla prowadzona w warunkach
najbardziej odpowiednich dla poszukiwanych
drobnoustrojów
Czas hodowli od kilku godzin (np. pałeczki
okrężnicy czyli Escherichia coli) do kilkunastu
dni (np. prątki gruźlicy czyli Mycobacterium
tuberculosis)
Wymagania wzrostowe bakterii
Zapotrzebowanie na tlen
Źródło węgla
Tlenowe – O2
Beztlenowe – mniej niż 1-0,5% O2
Mikroaerofilne – mieszanina 5% O2, 10% CO2,
85% N2
Autotroficzne – CO2
Heterotroficzne – aminokwasy, peptydy, cukry,
lipidy
Pozostałe związki niezbędne do wzrostu
Sole nieorganiczne
Witaminy
Czynniki fizykochemiczne
Temperatura
pH
Psychrofile – optimum 0-10C
Mezofile – optimum 20-40C
Termofile – optimum 50-60C
Większość bakterii preferuje neutralne wartości
pH ~ 7.0
Ciśnienie osmotyczne
Wiekszość preferuje aw ~ 0,99
Wzrost hodowli bakterii w podłożu
płynnym
Hodowla i identyfikacja
drobnoustrojów
Podłoże agarowe wzbogacone krwią – widoczna strefa
hemolizy dookoła kolonii
Hodowla i wstępna identyfikacja
drobnoustrojów
CPS
Podłoża wybiórcze,
wybórczo-różnicujące
chromogenne i specjalne
MacConkey agar
Oznaczanie mechanizmów oporności na
antybiotyki – podłoża chromogenne
MRSA
ESBL
VRE
Hodowla i identyfikacja
drobnoustrojów
Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem testów
wykonywanych na płytkach
wrażliwość na bacytracynę
test CAMP
Hodowla i identyfikacja
drobnoustrojów
Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem
zestawów probówkowych
gotowych testów
identyfikacyjnych
Systemy automatyczne
Systemy automatyczne stosowane są
do hodowli drobnoustrojów
(np. Bactec do posiewów krwi) lub
do identyfikacji i oznaczenia
lekowrażliwości wyhodowanych
wcześniej na podłożach stałych
drobnoustrojów
VITEK 2 Compact BioMerieux
Phoenix BD Diagnostic Systems
System VITEK 2 Compact
System automatyczny do identyfikacji i oznaczenia
lekowrażliwości drobnoustrojów wyhodowanych wcześniej
na podłożach stałych
Oznaczenie lekowrażliwości
drobnoustrojów
Oznaczanie metodą
rozcieńczeniową
Gotowe testy
diagnostyczne do
odczytu manualnego
Oznaczanie za
pomocą systemów
automatycznych
Oznaczanie lekowrażliwości i mechanizmów
oporności na antybiotyki
Dyfuzja z
krążka
Podłoże z
antybiotykiem
Dyfuzja
z paska
Szczep gronkowca
złocistego
(Staphylococcus aureus)
oporny na wszystkie
antybiotyki -laktamowe
(MRSA)
Metody immunologiczne
Testy lateksowe, ELISA,
immunofluorescencyjne
wykrywające całe komórki lub
antygeny bakterii (białka
powierzchniowe, wielocukry
otoczkowe, toksyny)
Pozwalają wykryć bakterie w
materiale pobranym od
chorego lub pomagają w
identyfikacji wyhodowanych
bakterii
Stosowane gotowe testy
manualne lub automatyczne
Aglutynacja lateksowa
Metody immunologiczne - EIA
Metody immunologiczne – systemy
automatyczne
System VIDAS
Nowe metody oparte o metody
immunologiczne
Spektrometria MALDI-TOF
Spektrometria MALDI-TOF
Spektrometria MALDI-TOF
Metody molekularne
Stosowane głównie metody oparte o reakcje PCR lub
real-time PCR
Dostępne różne gotowe testy komercyjne w dwóch
wariantach
Zestaw odczynników do wykrywania bakterii, reakcja
w dowolnym aparacie do PCR lub real-time PCR
Zestawy odczynników lub zamknięte systemy
diagnostyczne przeznaczone do użycia w aparacie
określonej firmy
Testy zarówno do wykrycia bakterii np. M.tuberculosis
jak i identyfikacji ważnych epidemiologicznie bakterii
np. MRSA lub wykrycia toksyn bakteryjnych
Genom bakteryjny
Chromosom bakteryjny o różnej wielkości w zależności od
gatunku bakterii oraz obecności wbudowanych elementów
ruchomych (plazmidów, transpozonów, bakteriofagów)
Metoda PCR
DNA
Ruler 100
6018/99
6758/99
ATCC43300
ATCC 29213
Ruler100
Metoda PCR
mecA
ok. 550 kb
mecA gen występujący
u MRSA
Real-time PCR
Krzywe reakcji real-time PCR
Szybkie testy molekularne np.
GeneXpert
Sondy typu Scorpion
Dwa rodzaje sond typu Scorpion
stosowane w testach z serii GeneXpert
rysunki: źródło Cepheid
Zintegrowana kontrola wewnętrzna w
mieszaninie reakcyjnej
Mg
2+
target scorpion
Taq DNA Polymerase
IC scorpion
dCTP
dGTP
dUTP
Internal Control
(IC)
dATP
rysunki źródło Cepheid
Mikromacierze
Bakteriofagi – wirusy bakteryjne
Bakteriofagi - morfologia
Bakteriofagi – cykle życiowe
Bakteriofagi – zastosowanie w
diagnostyce
Typowanie bakterii w celu określenia
pokrewieństwa izolowanych szczepów
łysinka
Bakteriofagi – zastosowanie w
detekcji i identyfikacji bakterii
Bakteriofagi – zastosowanie w
detekcji i identyfikacji bakterii
Bakteriofagi – zastosowanie w
detekcji i identyfikacji bakterii
Dziękuję za uwagę