Transcript wyklad 3_online

Podsumowanie – wykład 3
1. Technologia DNA
• Enzymy restrykcyjne – endonukleazy
• Trawienie restrykcyjne i ligacja DNA
• Topoizomeraza I
• Enzymatyczna metoda sekwencjonowania (Metoda Sangera)
2. Metoda PCR
• Etapy reakcji
• Warunki reakcji ( startery, polimeraza Taq)
• Startery specyficzne i zdegenerowane
• Typy polimeraz
• Zastosowanie PCR
3. Przykłady modyfikacji PCR
• RT-PCR
• Multipleks PCR
• Odwrotny PCR
• Real Time PCR
• RACE PCR
Nukleazy restrykcyjne - endonukleazy
Nukleazy
restrykcyjne
•
•
enzymy, które katalizują hydrolizę wiązań fosfodiestrowych:
tworząc końce 3’OH i 5’PO4
rozcinają DNA tylko w miejscach, określonych przez krótkie
sekwencje nukleotydów (od 4-8 par nukleotydów);sekwencje
palindromowe;
rożne szczepy bakterii zawierają różne nukleazy restrykcyjnemechanizm obronny przed obcym DNA;
„tępe końce”
„lepkie końce”
Nazwy enzymów pochodzą od gatunków, z których zostały wyizolowane po raz pierwszy np.
Heamophilus influanzae szczep Rd (Hind III) III- trzecia endonukleaza
Topoizomeraza I
Topoizomeraza I – pochodzi z wirusa Vaccinia ;
Topoizomeraza I
•
pełni jednocześnie fukncję endonukleazy i ligazy DNA
•
rozpoznaje specyficzną sekwencję pentamerową 5’-(C/T)CCTT-3’
•
w naturze enzym ten uwalnia tzw. superskręty w dsDNA
•
systemy komercyjne z liniowymi wektorami zawierają
topoimomerazę I przyłączoną do końca 3’ wektora, co ułatwia
ligację i czyni ją bardziej efektywną ( 95 % w porównaniu do 60% z
użyciem ligaz)
PCR
Etapy reakcji PCR
• Wstępna denaturacja ( 3min w 94°C)
• 25-35 cykli, każdy składa się z:
Denaturacji
95°C
1 min
Hybrydyzacji
50-60°C 30”-1min
Elongacji (syntezy)
72°C
1-2 min
•
Koniec reakcji – obniżenie temperatury do 4°C
MODYFIKACJE REAKCJI PCR
• RT-PCR – matrycą jest cDNA syntetyzowane z użyciem odwrotnej transkryptazy na
bazie mRNA
• Multiplex PCR – umożliwia jednoczesne amplifikowanie kilku genów, konieczne jest
dodanie do mieszaniny reakcyjnej kilku par starterów, produkty o różnej długości
łatwo rozdzielić podczas elektroforezy – test do wykrycia mikroorganizmów w wodzie
i pożywieniu
• Odwrotny PCR (inverse PCR)- amplifikacja fragmentów oskrzydlających z obu stron
odcinek DNA;
• Real Time-PCR – ilościowy PCR, PCR z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym,
umożliwia
monitorowanie
przebiegu
reakcji
PCR
poprzez
okreslanie
ilosci
powstajacego produktu w każdym cyklu z użyciem znaczników fluorescencyjnych np.
SYBR-Green I
• RACE PCR-(Rapid Amplification cDNA-Ends)- amplifikacja 3’ i 5’ końców cDNA znanego
fragmentu mRNA
Projektowanie starterów
OBLICZANIE TEMPERATURY HYBRYDYZACJI
1. Zasada: 2 + 4 2°C x (A+T) + 4°C x (C+G)
TACCTAGGTTGACCATCTACTAA
TACCTAGGTTGACCATCTACTAA = 9 G+C
TACCTAGGTTGACCATCTACTAA = 14 A+T
•
Tm = 2°C x (14) + 4°C x (9)
•
Tm = 28°C + 36°C = 64°C
2. Kalkulator
http://eu.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer
Kalkulator OligoAnalyzer 3.1
POLIMERAZY TAQ i PFU
• Syntezę DNA prowadzają polimerazy DNA najczęściej pochodzące z
termostabilnych bakterii
• Bakterie Thermus aquaticus odkryto w 1969 roku w gorących źródłach
• Polimerazę DNA Taq wyizolowano z tych bakterii w 1976;

maksymalna aktywność w temp. 70-80°C, optimum: 72°C ;

popełnia błąd średnio co 250 nukleotydów

nie posiada aktywności naprawczej 3’-5’ egzonukleazy

Okres półtrwania ponad 2 h (w 95° C)
• Polimeraza Pfu –polimeraza pochodząca z Pyrococcus furiosus,

posiada aktywność korekcyjną egzonukleazy i dzięki temu
wykazuje zredukowany wskaźnik błędów.