Transcript 配制MS培养基母液。
项目三 培养基配制技术 教学目标 教学终极目标 会配制MS固体培养基 促 成 目 标 能按照培养基配方熟练进行化学药品称量和 试剂配制 会使用高压灭菌锅灭菌 会阐述培养基配方成分在组培中的作用 项目介绍 培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生 长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、 含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。 有的培养基还含有抗菌素和色素。 按所用原料不同，可分为两类：应用肉汤、马铃薯 汁等天然成分配制的，称为天然培养基； 应用化学药品配成并标明成分的，称为合成培养基或综合 培养基。 工作任务 任务1 配制MS培养基母液。 任务2 配制MS固体培养基并灭菌。 任务一 MS培养基母液配制 一、母液种类 母液：将所用培养基配方的化学成分按一定的 比例配成浓缩液。 营养元素母液 大量元素母液 微量元素母液 铁盐母液 激素母液 二、母液的配制 1、大量元素 原则上可以混在一起，但硫酸镁与氯化钙要 单独配制，因为高浓度的Ca2+与Mg2+与磷酸盐混 合，会产生不溶性沉淀。 配制方法：用天平称取药品，分别加入600700ml蒸馏水中，再用磁力搅拌器搅拌，待第一 种药品溶解，加入第二种药品，最后定溶。或每 一种药品分别溶解，然后混合，最后定溶。 2、微量元素 用分析天平准确称取药品，分别溶解，依次混合， 最后定溶。有时KI单独配制。 3、铁盐母液 易沉淀，需单独配制，一般配成硫酸亚铁 （FeSO4·7H2O）与乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)的 铁盐螯合剂。 用少量蒸馏水将Na2-EDTA加热溶解后，再缓缓倒入 FeSO4溶液充分搅拌并加热5分钟，使其充分螯合。 4、有机物母液 分别称取药品，溶解，混合后加水定容。 5、激素母液 必需单独配制，储存于冰箱。 一般浓度为0.5-1mg/ml。 IAA、NAA、IBA、2，4-D等，可先用0.1mol/L 的NaOH或95%的酒精溶解，然后定溶。 KT、BA等细胞分裂素应先溶于少量0.1mol/L的HCl， 然后定溶。 药品 名称 原配方量 (mg)/ L 扩大倍数 称取量 (mg) NH4NO3 1650 10 16500 KNO3 1900 10 19000 CaCl·2H2O 440 10 4400 MgSO4 ·7H2O 370 10 3700 KH2PO4 170 10 1700 MnSO4·H2O 22.3 100 2230 ZnSO4·7H2O 8.6 100 860 CoCl·6H2O 0.025 100 2.5 CuSO4·5H2O 0.02 100 25 H3BO3 6.2 100 620 Na2MO4·2H2O 0.25 100 25 KI 0.83 100 83 FeSO4·7H2O 28.7 100 2870 Na2-EDTA 37.3 100 3730 烟酸(Vpp) 0.5 50 25 盐酸吡哆醇 0.5 50 25 盐酸硫胺素 0.1 50 5 肌醇 100 50 5000 甘氨酸 2 50 100 母液体积 (ml) 移取量ml/L 1000 100 1000 10 1000 10 500 10 ＭＳ培养基母液的配制 （1）大量元素母液（10X）： 称10升量溶解在1升水中。配1升培养基取100ml。 组成 B5（改良） MS mg/L g/10.L NH4NO3 1650 16.5 KNO3 1900 CaCl2•2H2O N6 mg/L g/10.L mg/L g/10.L 19.0 2500 25.0 2830 28.3 440 4.4 150 1.5 166 1.66 MgSO4•7H2O 370 3.7 250 2.5 185 1.85 KH2PO4 170 1.7 400 4.00 463 4.63 (NH4)2SO4 150 1.5 NaH2PO4•H2O 150 1.5 或 NaH2PO4•2H2 O 168 1.68 （2）微量元素母液（100X）： 称10升量溶解在100ml水中。配1升培养基取10ml 组成 B5（改良） MS N6 mg/L mg/10.L mg/L mg/10.L mg/L mg/10.L H3BO3 6.2 62 3 30 1.6 16 MnSO4•H2O 21.4 214 10 100 4.2 42 ZnSO4•7H2O 8.6 86 2 20 1.5 15 Na2MoO4•2H2O 0.25 2.5 0.25 2.5 CuSO4•5H2O 0.025 0.25 0.25 2.5 CoCl2•6H2O 0.025 0.25 0.25 2.5 KI 0.83 8.3 0.75 7.5 （3）铁盐母液（100X）： 称10升量溶解在100ml水中。配1升培养基取10ml。 组成 MS或 B5（改良） mg/L mg/10.L Na2•EDTA 37.3 373 FeSO4•7H2O 27.8 278 将上述两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中 EDTA（乙二胺四乙酸二钠）较难溶解完全，急需时可适量 加热，当两者均充分溶解完全后，先取一种置容量瓶中， 然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液为 好，最后定容。 （4）维生素母液（100X）： 称10升量溶解在100ml水中。配1升培养基取10ml 组成 B5（改良） MS g/10.L mg/L g/10.L 肌醇 mg/ L 100 1000 100 1000 烟酸 0.5 5 1 10 盐酸吡哆 （VB6） 0.5 5 1 10 盐酸硫胺素 （VB1） 0.4 4 10 100 2 20 甘氨酸 N6 mg/ g/10.L L 配制母液注意几点： 配制倍数不宜过高，可避免浪费；也可避免倍 数过高，吸取量相对少而影响准确性。 母液配制好后应放在2～4℃冰箱内保存。 母液贮备时间不宜过长。过长时宜出现沉淀和 微生物污染。 任务二、MS培养基的配制与灭菌 一、MS培养基的配制 配制方法： 1、将母液按顺序摆放 2、取适量的蒸馏水(所需培养基量的2/3)入容器 3、按需要量依次取母液（吸取量=配制浓度 × 体积 / 母液浓度）及生长调节物质 4、加入蔗糖(30g/L)溶解 5、加琼脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min 6、定容 7、调PH值(pH=5.8) 8、分装培养瓶，封口 9、高压灭菌 糖 ③ 琼脂 适量水 加热溶解 定容 ④ ① ⑤ ② 母液 调pH值 分装 ⑥ 灭菌 ⑦ 配制流程 湿热灭菌 辐射灭菌 过滤灭菌 二、培养基的灭菌 湿热灭菌法 培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。 高压灭菌的原理： 在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力 不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温 度也随之增加。在108kPa的压力下，锅内温度 达121℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各 种细菌及其高度耐热的芽孢。 过滤灭（除）菌（不耐热的物质 ） 一些生长调节剂(赤霉素、玉 米素)、某些维生素是不耐热的， 常用过滤灭菌-细菌过滤器方法。 防细菌滤膜网孔的直径为0.45μm 以下，可阻止细菌细胞和真菌的 孢子通过。 实践操作 一、配制MS培养基母液 二、配制MS固体培养基并灭菌 问题探究 一、培养基成分： 1、无机营养：大量元素 微量元素 铁盐 2、有机营养成分：有机附加物 氨基酸 维生素 肌醇 糖类 3、植物生长调节物质： 生长素 细胞分裂素等 4、琼脂 5、活性炭 6、pH 7、水 8、天然物质： 椰乳（CM） 酵母提取物（ME） 麦芽提取物（YE） 1、无机营养元素(inorganic element) 1)大量元素：指浓度大于0.5mmol／L的元素。 [C、H、O、N、P、K、Mg、S和Ca]。 大量元素占植物体干重的百分之几十至万分之几的分量。 N分硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+），不同离体组织所需 的含量不一致，单独使用易导致培养基酸碱性漂移两者要保持 适当比例。 2)微量元素：指小于0.5mmol／L的元素。 铁（Fe）、铜（Cu）、锌（Zn）、锰（Mn）、钼（Mo）、硼 （B）、碘（I）、钴（Co）、氯（Cl）、钠（Na）等 Fe：易形成絮状沉淀，常以Fe ·EDTA 的形式提供。 FeSO4 ·7H2O＋Na2 ·EDTA 两类元素虽然在培养基中含量差距很大， 但都是不可少的营养成份。含量不足就造成缺素症。 2、有机化合物(organic compound) （1）碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好 的碳源，麦芽糖、半乳糖、甘露糖也有所应用。 使用浓度在1%—5%，常用3% 在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。 糖类作用：在组织培养中用作离体组织生长的碳源，维持 培养基一定的渗透压。 培养效果有差异：葡萄糖＞果糖=蔗糖＞麦芽糖 （2）维生素(vitamin) 在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢 。 活动对离体组织的生长具有明显的促进作用，主要为 B族维生素 。 种类： VBl(盐酸硫胺素)、 VB3（泛酸）、 VB6(盐酸吡哆醇)、 Vpp(烟酸) Vc（抗坏血酸）、 VH(生物素) VB11(叶酸)、 VB12（钴胺素)等。 使用浓度： 一般用量为0.1-1.0mg／L。 Vc具有很强的还原能 力，常用于防止组织 褐变。 （3）肌醇 又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作 用。 使用浓度：一般为lOOmg／L。 作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长 以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分 化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。 （4）氨基酸 (almino acide） 作用：蛋白质的组成部分，也是一种有机氮化 合物。是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、 谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等 半胱氨酸及多种氨基酸的混合物（水解酪蛋白、水 解乳蛋白）等。 使用浓度：为10-200mg／L。 当有机氮为唯一氮源时，离体组织生长不良，只有在 无机氮存在的条件下，才能取得理想的效果，它的主要作 用是促进细胞生长。如： 酪蛋白水解物和胰蛋白水解产生的胨能增进国兰类组 织的生 长，300mg/L谷氨酰胺也能起到同样的作用， 精氨酸对卡特兰、万代兰未成熟的种子有刺激其生长的 作用 天门冬酰胺有促进国兰类籽苗生长的作用 3、有机附加物 （天然复合物） 成分不固定，主要有效成份大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。 作用：它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。 有机附加物 浓度 椰乳 10%—20% 香蕉 150-200ml／L 150—200g／L 0.01%-0.05% 0.01%-0. 5% 马铃薯 酵母提取液 麦芽提取物 如: 在组织培养蝴蝶兰时，常加入香蕉泥或椰乳，可明显促进 原球茎发育成完整植株并加速小苗的生长。 4、植物生长调节物质(hormone) 植物生长调节物质是一些对植物生长发育及生理活动有 特殊作用的生理活性物质。 这类物质极少量存在就对植物生命活动起到调节作用， 有些可以刺激植物生长，而有些抑制植物生长。 在组织培养中，植物生长调节物质对愈伤组织的诱导、 器官分化的植株再生具有重要的作用。 主要包括： 生长素类(auxin) 细胞分裂素类 ( cytokinin ) 赤霉素（gibberellic acid） （1）生长素类 概念：指能引起完整组织中的细胞扩展的化合物，主 要生理作用是促进细胞的纵向伸长，生长素包括内源的 （存在于植物体内的）和人工合成的。 组培中的作用：主要被用于诱导愈伤组织 形成，促进细胞伸长生长和促进生根。 用量：mg/L级，mg/L=ppm 用法：溶于95％乙醇或0.1mol/L NaOH 生长素的作用具有两重性： 既促进生长，又能抑制生长、甚至杀死植物； 既促进发芽，又会抑制发芽； 既能防止落花落果，又可疏花疏果。 这取决于浓度、细胞的年龄和器官的种类。 一般低浓度促进生长，中浓度抑制生长，高 浓度则杀死植物。 在细胞年龄上幼年细胞比成熟 细胞敏感。 生长素的应用 农业生产中的作用： 组培中的作用： 插枝生根 诱导愈伤组织的产生， 防止器官脱落 促进细胞脱分化 诱导菠萝开花 组织培养促进细胞伸长 促进果实形成 促进生根 在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度 下，(10-5-10-8mg/L)就可促进生长，其次是茎和芽。 生长素种类： 吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid） 萘乙酸：NAA（naphthalene acetic acid） 吲哚丁酸：IBA（indolebutyri acid） 2,4-二氯苯氧乙酸：2,4—D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid) 另外：吲哚丙酸(IPA)、萘氧乙酸(NOA)等 NAA、IBA→生根培养 2,4-D →愈伤组织诱导与增殖 生长素作用强弱顺序： 2,4—D(2,4—二氯苯氧乙酸) 强 NAA(萘乙酸) IBA(吲哚丁酸) IAA(吲哚乙酸) 弱 （2）细胞分裂素类 概念：是一类具有促进细胞分裂和其他生理功能的物质总称。都 为腺嘌呤的衍生物。在高等植物中普遍存在，特别是茎尖、根尖、 未成熟的种子和生长着的果实等进行着细胞分裂的器官。 细胞分裂素作用： ①促进细胞分裂与扩大。 ②诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。 ③抑制根的分化。 用量：mg/L级 用法：溶于0.5mol/L 稀HCl或稀NaOH，通常多用 NaOH助溶。 生理作用和应用： 1）促进细胞分裂和扩大 在组织培养中，当培养基缺少细胞分 裂素时，细胞很少分裂、生长，加入细 胞分裂素后，细胞就进行分裂，组织增 大，产生愈伤组织。细胞分裂素可以使 细胞横向扩大而不是伸长。 在生产中可以对绿肥、叶用蔬菜等叶 用作物施用一些细胞分裂素，能够增产。 2）延迟衰老和保鲜 作用原理：阻止核酸酶和蛋白酶等水解酶的产 生；阻止营养物质向外流动并使其向细胞分裂素所 在的部位运输，促进物质的积累。 在生产上可以用于防止贮藏蔬菜的变质，延长 贮藏时间。 3）诱导芽的分化 在愈伤组织的分化培养中，产生根或芽，取决于生长素 与细胞分裂素浓度的比值。 例如，在烟草愈伤组织培养时，当激动素：生长素为 0.02：2mg/L时，能诱导根的分化；两者比值为0.2： 2mg/L时，愈伤组织只生长不分化；当激动素的比例提 高到0.5：2mg/L时，能诱导芽的分化。 4）其他 促进侧芽发育，防止果树生理落果， 可打破种子的休眠，促使其发芽。 常用种类： 6-BA(6-苄基腺嘌呤) Kt (kinetin 激动素) Zt (zeatin 玉米素) 细胞分裂素作用强弱顺序 Zt (玉米素) 强 6-BA(6-苄基腺嘌呤) Kt ( 激动素) 弱 （3）赤霉素 GA3（赤霉素）：最初从赤霉菌中提取到，能够引起水稻 等植株徒长。在组织培养中有时使用，如用于匍匐茎的诱 导。 作用：通过调节生长素的含量实现促进细胞伸长的。促进 幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株打破休眠。多用 GA3。 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当 生长素/赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有 利于韧皮部分化。 用量：mg/L级 用法：易溶于水、乙醇，多用95％乙醇溶解储存。 另外： 脱落酸（ABA） →因物种不同，能促进 或抑制愈伤组织生长； 乙烯（Eth） →有催熟作用，大量积累 易影响生长、分化，导致培养物早衰、落 叶和玻璃化苗，应尽量排除之； （BR）→可能与CYT有类似作用，有待研 究。 紫罗兰组织培养 选择适合植株增殖的生 长培养基，外植体表面长满 绿色幼苗和并长出很多小根。 糖对紫罗兰组培的影响 No sucrose (0%) Sucrose to 1% 外植体发生很少的 幼苗，不产生根和 愈伤组织 外植体表面产生幼 苗，并产生少量的 根。 Sucrose to 5% 外植体表面产生很多幼 苗，同时幼苗基部产出 很多根，原因是培养基 中加入适合的控制物质。 细胞分裂素- BA对紫罗兰组培的影响 No BA BA reduced to 0.1 mg. l-1 A：BA(0mg/L) ，芽（减少），根（增多）愈伤组织（定量） B：BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（定量） 6、抗生物质(antibiotic) 种类：青霉素、链霉素、利福平、卡那霉素庆 大霉素等。 浓度：5-20mg/L。 作用：可防止菌类污染，主要抑制内生菌。 多数需过滤灭菌 7、活性炭(active carbon) 目的：是利用其吸附能力，减少一些有毒物 质的影响。 如：用于防止酚类物质污染引起组织褐化死 亡。也能使培养基变黑，有利于某些植物生根。 使用浓度：1- 5g/L。 它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附 能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力减弱， 甚至不吸附。 8、水（water) 作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过 程的介质和溶媒。 注意： 用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成分的精确性。 配制培养基母液时要用蒸馏水，大规模生产时可用自来水。 但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良果。 二、培养基的PH值 (pH value) 1、多数植物要求pH5.6-5.8 2、常用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl来调节。 3、注意： 经高压灭菌后，培养基pH会下降0.2-0.8,故调整pH 值时,应高于0.5； pH的大小会影响琼脂的凝固能力，当pH>6.0时，培 养基将会变硬，pH <5.0时，琼脂凝固不好。 不同植物对培养基最适pH值的要求不同(见表) 种类 最适pH值 种类 最适pH值 杜鹃 4.0 月季 5.8 越桔 4.5 胡萝卜、石刁柏 6.0 蚕豆 5.5 桃 7.0 番茄 5.7 拓展知识 培养基的选择 (一）培养基的种类 （二）常用的培养基的特点 （三）培养基的筛选 (一）培养基的种类 培养基按试验目的分为： 1、诱导培养基 （脱分化培养基）： 外植体诱导发生愈伤组织的培养基。 水稻诱导愈伤组织时加2.4-D；而烟草、胡萝卜既需 生长素，又需细胞分裂素。 2、继代培养基： 诱导出愈伤组织后，使愈伤组织能不断地生长下去的培 养基。 3、分化培养： 由愈伤组织诱导形成小苗（幼芽或胚状体）的培养基。 ① 不加任何激素的基本培养基，即可诱导分化。如水稻、 珍珠粟、甘蔗等植物。 ② 加较高浓度细胞分裂素和少量生长素培养基。如烟草、 矮牵牛、四季海棠、天竺葵、菊花、倒挂金钟等组织的分 化。贴梗海棠:MS+BA3+IAA0.1+NAA0.2 ③ 需要有一种或一种以上的生长素的培养基，如枸杞、苜 蓿、百合、唐菖蒲等。 ④ 只加细胞分裂素的培养基。如豌豆、油菜、小麦等。 4、生根培养基： 诱导再生小苗生根的培养基。 ① 在无任何生长激素的基本培养基中就可生出良好的根系。 如烟草、红薯、草莓、枸杞等。 ② 有些需加入少量的NAA、IAA或IBA以诱导根。 ③ 有些需要减低培养基中无机盐的浓度。如用MS 培养基 中1/2或1/4的无机盐诱导生根，常可获得良好的效果。 培养基按其物理性质划分为： 固体培养基 在培养基中加入一定量的凝固剂，使液体培养基固化. 优点：使用方便，占地不大。 缺点：培养外植体只能有部分组织与培养基接触，培养 物上下部因接受养分不均匀，引起组织生长的差异。 液体培养基 培养物消毒后直接置于液体培养基中培养。 优点：培养物吸收营养比较充分，容易获得均匀一致的 细胞群体。 缺点：转换培养基较麻烦。 （二）常用的培养基的特点 MS培养基 无机盐数量适宜，硝酸盐、钾和铵盐的含量比其他培 养高。应用最广泛。主要用于园艺植物、木本植物、 花卉、蔬菜等的组织培养。 B5培养基 铵的含量较低。在豆科植物上应用最多。 培养大豆细胞和组织培养设计。 White培养基 成分比较简单，无机盐和糖的用量低。 （三）培养基的筛选 1.实验前的准备工作 文献检索 参观咨询 2.预备试验 3.常用的试验方法 单因子试验、多因子试验及广谱实 验等。 1.筛选：在多种培养基上培养，根据培养物的 生长情况，确定较适宜的培养基。 2.调整：根据培养物的生长情况或培养目的的 不同，对培养基进行调整，探索新的培养基。 如：改良MS、改良B5培养基、N6培养基等。 筛选合适的培养基 ——组培成功的基础 考 虑： 一、筛选基本培养基 在多种培养基上培养，根据培养物的生长情况，确定 较适宜的培养基。 二、调整各种激素的浓度及相对比例 根据培养物的生长情况或培养目的的不同，对培养基 进行调整，探索新的培养基。 如：改良MS、改良B5培养基、N6培养基等。 怎么选择基本培养基？ 如：新的植物材料 MS：大多数双子叶植物 B5和N6：许多单子叶植物，N6禾本科小麦、水 稻 White 适合于根的培养 怎么根据实际情况来调整某些成分？ 1、用一种化合物作为N源时，硝酸盐的作用比 氨盐好，单独使用硝酸盐会使pH向碱性方向漂 移，同时加可克服。 2、根据某些元素供应不足的症状。 激素浓度和相对比例如何确定？ （1）查阅文献 （2）拟用激素选择3-5个水平，随机组合建立实验方案。 两种激素4种浓度的第一次组合实验 序号 CTK /mgL-1 0.5 1.5 3 1 5 9 13 2 6 10 14 3 7 11 15 4.5 auxin/mgL-1 0 0.5 1.0 2.0 4 8 12 16 第二次激素配比实验 序号 CTK/mgL-1 1.0 1.25 1.5 1 5 9 2 6 10 3 7 11 1.75 Auxin/ mgL-1 0.25 0.5 0.75 4 8 12 在此基础上可进行培养基他成分的变动实验。如蔗糖、琼脂、 pH、氨基酸等。 培养基配方试验方法 一、单因子试验 二、多因子试验 三、逐步添加和逐步排除 试验法 四、广谱实验法 一、单因子试验 培养基中其他成分都维持在一般水平上，只变动 生物学试验不同于物理学或化学试验，最显著的 试验中各处理一般都要设有一定的重复，以取得 一个因子，找出这一因子对试验的影响和影响的 差别是在生物学试验中必需设置对照组与试验组。 可靠的试验结果。随试验规模和要求不同，大多 程度。例如MS基本培养基，只变动NAA用量对某 试验中要求对照组与试验组中的试验个体，即植 每个项目要有4-10瓶，每瓶至少3块培养物或3丛 一培养物生根的影响，这种只研究一个因素的试 物组织块或其他培养物，必须在遗传性、生理状 小幼苗。 验就是单因子试验。 态、前培养条件等方面，尽可能完全一致。以保 证试验结果是来源于试验因子，而不是由于试验 材料的不一致导致的。 二、多因子试验 对培养基中两个或两个以上因素进行研究的 试验称为多因子实验。试验可采用完全试验 方案，也可选用正交设计方案。 1、完全试验 完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每 个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合。 L9(34) 2、正交试验 完全试验方案试验因子 处理号 列号 1 2 3 4 越多，处理数越多，试 1 1 1 1 1 验越复杂，消耗的精力、 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 物力越多。为了减少试 验处理，但又能准确全 面地获得试验信息，通 常采用正交试验。 Latin square 组 一般正交试验设计 第一步：确定试验指标。Objective index 第二步：挑因素(factor)、选水平(level) 因素水平表（出愈率） 水平 1 2 3 NAA 1.5 0.5 0.2 因素 6-BA KT 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.1 品种 丰香 明宝 红颊 第三步：选正交表。看 水平，选几水平表 处理号 看因素数，选列数；看试 验次数。 第四步：“对号入座”， 列试验方案 第五步：进行试验，收集 试验数据 第六步：分析结果，挑选 较优水平组合 列号 1 2 3 4 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 组 正交试验的优点 4个因子，3种水平的试验，一共做9种不同搭配的试验， 其结果相当于做了27次搭配试验。虽然是多因素搭配在一起， 但试验结果分析，每一种因素所起的作用却能明白无误地表 现出来。 因此，一次系统的试验结果，就可以把问题分析得清清 楚楚，用有限的时间取得成倍的收获。组培研究中，同时探 求培养基中适宜的几种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、 糖和其他成分的用量。 三、逐步添加和逐步排除试验法 在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分 化与再生之前，添加各种有机营养成分，而在取得了稳定的 再生之后，就可以逐步减少这些成分。 逐步添加时是使试验成功。 逐步减少时是缩小范围，以便找到最有影响力的因子，或是 为了实用上的需要使培养基简化，以降低成本和利于推广。 在寻求最佳激素配比时，用到这种加加减减的方法。 四、广谱实验法 广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类：无机 盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、细 胞分裂素。 对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高(H)3个浓度。 4类物质各3种浓度的自由组合即构成了一项包括81个 处理的实验。 在这81个处理中最好的一个可用4个字母表示。例如， 一个包含中等浓度无机盐，低等浓度生长素、中等浓度细 胞分裂素和高等浓度有机营养物质的处理即可表示为MLMH。 达到这个阶段，再试用不同类型的生长素和细胞分裂 素即可找到培养基的最佳配方。这是因为不同类型的生长 素和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。 课后作业 1、称量、吸取母液基本功训练 2、思考题 （1）什么叫母液？配制时应注意什么？ （2）常用的激素有哪些？其作用是什么？ （3）培养基有哪些成分组成？ （4）如何配制固体培养基？配制时应注意 哪些问题？ （5）如何筛选培养基？