Transcript 植物组织培养

植物组织培养
Plant tissue culture
目
录
绪论
 第一章 实验设备及技术

第二章 外植体的选择及灭菌
 第三章 外植体的接种培养及驯化
 第四章 愈伤组织的培养
 第五章 器官和体细胞胚的发生
 第六章 植物快繁与脱毒

绪
论
植物组织培养是二十世纪发展起来新技
术，近几十年来，由于组培基础理论的
研究深入，发展极为迅速，几乎以植物
为研究对象的各个分支学科都在广泛进
行组培。
 定义：是指植物的任何器官、组织或细
胞，在人工预知的控制条件下，放在含
有营养物质和植物生长调节物质等组成
的培养基中，使其生长、分化形成完整
植株的过成。

一、 植物组织培养的分类及
相关概念
1 根据培养的对象不同，可分为：
 器官培养（organ culture）
 组织培养（meristem culeure）
 胚胎培养（embryoid culeure ）
 细胞培养（cell culeure ）
 原生质体培养（protoplast culeure ）

2 根据培养过程不同，分为
 初代培养（primary culture）


继代培养（ subculture）
3 根据培养基物理状态，分为
固体培养（solid culture）

液体培养（liquid culture）


4 相关概念
（1）外植体（explant）：由活体（in vivo）
上提取下来的，接种在培养基上的无菌细
胞、组织、器官等。
（2）愈伤组织（callus）：在人工培养基上
由外植体形成的一团无序生长状态的薄壁
细胞。
（3）分化（differentiation）：指由受精卵经
细胞分裂，引起极性生长发育成种子，经
根、茎、叶生长，开花结实，形成完整植
株。

（4）脱分化（dedifferentiation）：由高度
分化的植物组织或器官产生无分化状态
的愈伤组织的过程。
（5）再分化（redifferentiation）：将脱分
化形成的愈伤组织转移到适当的培养基
上继续培养，这些无定形的愈伤组织又
会重新分化出根、茎、叶的完整植株的
过程。
二、植物组织培养的理论依据
及特点

（一）理论依据
植物细胞的全能性（totipotency）：
是指植物体任何一个细胞都携带着一套
发育成完整植株的全部遗传信息，在离
体培养条件下，这些信息可以表达，产
生出完整植株。
原理：生物体的每一个细胞都包含有该
物种所特有的全套遗传物质，都有发育
成为完整个体所必须的全套基因，从理
论上讲，生物体的每一个活细胞都应该
具有全能性。
 差异：
（1）受精卵的全能性最高
（2）受精卵分化后的细胞中，体细胞的全
能性比生殖细胞低。

潜在全能性的原因：
基因表达的选择性
 科学研究表明：处于离体状态的植物活
细胞，在一定的营养物质，激素和其他
外界条件的作用下，就可能表现出全能
性，发育成完整植株。人工条件下实现
的这一过程，就是植物的组织培养。
 要使细胞全能性表达出来，形成完整植
株，除了生长以外，还要经过分化、脱
分化和再分化等过程。


在正常情况下：
受精卵—分裂、分化—种子—萌发—
完整植株（具有根、茎、叶、花、果实）
在离体条件下：
离体组织、器官 （在培养基上） 细胞
分裂（脱分化） 愈伤组织 再分化
完整植株（具有根、茎、叶、花、果实）

（二）植物组织培养过程：
植物体 （分离）外植体 （脱分化）愈伤
组织 （再分化）生长点 完整植株（具有
幼根、幼茎）
（三）植物组织培养条件：
含有全部营养成分的培养基、一定的温
度、空气、无菌环境、适合的PH、适时
的光照。
 （四）离体器官的分化方式主要有三种；
1 、由分生组织直接分生芽
2 、由分生组织形成愈伤组织，经过再分
化形成完整植株实现细胞全能性。
3 、 由游离的细胞或原生质体形成胚状体
（embryoid），直接重建完整植株，或
制成人工种子后重建植株


（五）植物组织培养的特点
1、优越性：可以在不受植物体其他部分
干扰的情况下研究被培养部分（外植体）
的生长和分化规律。
2、 特点：
（1）取材少，培养材料经济
（2）人为控制培养条件，不受自然条件影
响。
（3）生长周期短，繁殖率高，
（4）管理方便，利于自动化控制

3、重要性：
（1）理论上：是研究细胞学、遗传学、
育种学、生物化学和药物学等学科的重
要手段。
（2）生产上：在农学、园艺、林业和次
生代谢物工程等生产领域得到广泛应用。
三、植物组织培养的发展历史

1902年，德国植物学家Haberlandt提出细
胞全能性的概念。
 1904年，E. Hanning 培养萝卜和辣根菜属
的一种植物的胚，使其发育成熟。
 1908年，S. simon 研究培养白杨嫩茎，观
察到愈伤组织的发生和根芽的形成。
 1958年，美国科学家Steward等和德国
Reinert分别用胡萝卜根细胞诱导形成胚
状体，使细胞全能性得到证实，为组织
培养技术程序奠定了基础。

1960年，E. C.cocking采用纤维素酶,果胶酶等
酶制剂分离番茄幼根，获得大量健康的原生
质体。
 1962年，Murashige和Skoog在烟草培养中筛
选出至今仍然被广泛使用的MS培养基。
 1964年，印度科学家S. Guha和 Msheshwari培
养南洋金花未成熟的花药时，发现了由大量
胚状体形成的小植株（单倍体植株）。
 罗士韦是我国植物组织和细胞培养研究的开
拓者和奠基人之一。在30年代即开始离体根
的培养，随着又进行幼胚和茎尖的培养。

70年代初期开始，我国掀起了单倍体育
种的高潮，在小麦、水稻、烟草、玉米、
三叶橡胶等作物上取得了一批有意义的
成果。
 80-90年代，全国研究工作内容明显倾向
无性系的快速繁殖，许多机构开始转向
应用，成为生产实体，如甘蔗、草莓、
葡萄、菠萝、香蕉，各色观赏植物等。
 现在，我国在原生质体培养，体细胞杂
交、突变体筛选、去除病毒、次生代谢
物的发酵生产、人工包装超级种子等方
面都有了进步。
四、植物组织培养的应用

1、快速繁殖：运用组织培养途径，一个
植株一年可以繁殖几万到几百万个植株，
例如，一株葡萄一年繁殖3万多株，一株
兰花一年繁殖到400万株。
 2、种苗脱毒：针对病毒对农作物造成的
严重危害，通过组织培养可以有效地培
育出大量的无病毒种苗，已经取得的有
马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等。

3、远缘杂交：利用组织培养可以使难度
很大的远缘杂交取得成功，从而育成一
些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所
利用这一方法获得了苹果与梨的杂交种。

4、突变育种：采用组织培养可以直接诱
变和筛选出具抗病毒、抗盐、高赖氨酸、
高蛋白等优良性状的品种。象中国林科
院用逐步加大培养基中盐的浓度，直接
获得耐盐的杨树株系。

5、基因工程：基因工程主要研究DNA的
转导，而基因转导后，必须通过组织培
养途径才能实现植株再生。

6、生物制品：有些极其昂贵的生物制品，
比如抗癌首选药物—紫杉醇等，可以用
大规模培养植物细胞来直接生产。
第一章 实验设备及技术
在进行植物组织培养工作之前，首先
对工作中需要哪些最基本的设备条件有
个全面了解，以便因地制宜地利用现有
房屋，或新建、改建实验室。实验室的
大小取决于工作的目的和规模。以工厂
化生产为目的，实验室规模太小，则会
限制生产，影响效率。在设计组织培养
实验室时，应按组织培养程序来设计，
避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。
第一节
实验室
植物组织培养是在严格的无菌的条件下
进行的，要做到无菌的条件，需要一定
的设备、器材和用具，同时还需要人工
控制温度、光照、湿度等培养条件。
1、实验室设计原则：保证无菌操作，达
到工作方便，防止污染。
2、实验室组成：
化学实验室、洗涤菌室、无菌操作室（接
种室）、培养室、细胞学实验室。
化学实验室（准备室）：完成所使用的
各种药品的贮备、称量、溶解、配制、
培养基分装等。
主要设备：药品柜、防尘橱（放置培养
容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度
计及常用的培养基配制用玻璃仪器。
 洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、
干燥、保存、培养基的灭菌等。
主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、
干燥灭火器（如烘箱）等。


无菌操作室（接种室）：主要用于植物
材料的消毒、接种、培养物的转移、试
管苗的继代、原生质体的制备以及一切
需要进行无菌操作的技术程序。
主要设备：紫外光源、超净工作台、消
毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、
剪刀、解剖刀、接种针）等。
接种室宜小不宜大，一般7~8平米，要求
地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，
易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少
开关门时的空气扰动。
接种室要求干爽安静，清洁明亮，在适
当位置吊装1~2盏紫外线灭菌灯，用以照
射灭菌。最好安装一小型空调，使室温
可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界
空气对流。
 接种室应设有缓冲间，面积为1m²为宜。
进入无菌操作室前在此更衣换帽，以减
少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最好
也安装一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭
菌。

培养室：培养室是将接种的材料进行培
养生长的场所。培养室可根据需要培养
架的大小、数目、及其他附属设备而定。
其设计以充分利用空间和节省能源为原
则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁
要求有绝热防火的性能。
 培养材料放在培养架上培养。培养架大
多有金属制成，一般设5层，最低一层离
地面高约10cm，其他每层间隙30cm左右，
培养架即高1.7m左右。培养架的长度是
根据日光灯的长度而设计的，如采用
40W的日光灯，则长1.3m，30W的长度
为1m，宽度为60cm。

培养室最重要的因子是温度，一般保持
在20~27°C左右，具备产热装置，并安
装窗式或立式空调机。由于热带植物和
寒带植物等不同种类要求不同温度，最
好不同种类有不同的培养室。
 室内温度也要求恒定，相对湿度以保持
在70%~80%为好，可安装加湿器。控制
光照时间可安装定时开关钟，一般需要
每天光照10~16小时，也有的需要连续照
明。短日照植物要求短日照条件，长日
照植物要求长日照条件。

现代组培实验室大多设计为采用天然太
阳能作为主要能源，这样不但可以节省
能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，
驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。
 主要设备：培养架（控温控光控湿）、
摇床、培养箱、紫外光源等。

细胞学实验室：用于培养物的观察分析
与培养物的记数等。
 主要设备：双筒实体显微镜、显微镜、
倒置显微镜。
 其他小型仪器设备：分注器、血球计数
器、移液器、过滤灭菌器、电炉等加热
器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。

第二节 植物组织培养的
培养条件

一、营养条件—培养基（culture medium）
培养基：是植物组织培养的重要基质。在
离体培养条件下，不同种植物的组织对培
养有不同的要求，甚至同一种植物不同部
位的组织对营养的要求也不相同，只有满
足了它们各自的特殊要求，它们才能很好
地生长。因此，没有一种培养基能够适合
一切类型的植物组织或器官，
在建立一项新的培养系统时，首先必须
找到一合适的培养基，培养才能成功。
 培养基的种类
培养基有许多种类，根据不同的植物
和培养部位及不同的培养目的须选用不同
的培养基。
培养基的产生，最早是Sacks（1680）
和Knop（1681），他们对绿色植物的成分
进行了分析研究，根据植物从土中主要是
吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成
的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本
的无机盐培养基得到广泛应用。
以后根据不同目的进行改良产了许多培
养基，White培养基在40年代用得最多，
现在还常用。而到60-70年代则大多采用
MS等高浓度培养基，可以保证培养材料
对营养的需要，并能生长快、分化快，
且由于浓度高，在配制、消毒过程中某
些成分有些出入，也不致影响培养基的
离子平衡。
 培养基的名称，一直根据沿用的习惯。
多数以发明人的名字命名，如White培养
基，Murashige和Skoog培养基（MS培养
基），也有对某些成分进行改良的改良
培养基。
 目前国际上流行的培养基有几十种，常
用的培养基及特点如下：
（1）MS培养基：它是1962年由Murashige
和Skoog为烟草细胞而设计的。特点是无
机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡
溶液。其养分的数量和比例较合适，可
满足植物的营养和生理需要。它的硝酸
盐含量较其他培养基为高，广泛用于植
物的器官、花药、细胞和原生质体培养
效果良好。有些培养基是由它演变而来。
（2）B5培养基：是1968年由Galmborg等为培
养大豆而设计的。其主要特点是含有较低
的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制
作用。从实践得知有些植物在B5培养基上
生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植
物。
（3）White培养基：是1943年由White为培养
番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，
称作White改良培养基，提高了MeSo4的浓
度和增加了硼素。其特点是无机盐数量较
低，适于生根培养。
（4）N6培养基：是1974年朱至清等为水稻
等禾谷类作物花药培养而设计的。其特
点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4
的含量高。在国内已广泛应用于小麦、
水稻及其他植物的花药培养基和其他组
织培养。
（5）KM—8P培养基：它是1974年为原生
质体培养而设计的。其特点是有机成分
较复杂，它包含了所有的单糖和维生素，
广泛用于原生质体融合的培养。

培养基的成分主要可以分为水、无机盐、
有机物、天然复合物、培养体的支持材
料等五大类。
水（H2o）

是植物原生质体的组成成分，也是一切
代谢过程的介质和溶液。它是生命活动
过程中不可缺少的物质。配制培养基母
液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基
成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。
大规模生产时可用自来水。但在少量研
究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引
起不良效果。
无机元素（inorganic element）
大量元素：指浓度大于0.5/L的元素等，其作
用是：
 （1）N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、
核酸、磷脂、生物碱等的组成成分。是生命
不可缺少的物质。在制备培养基时以NO3—
N和NH4—N两种形式供应。大多数培养基既
含有NO3—N又含有NH4 —N。 NH4—N对植
物生长较为有利。供应的物质有KNO3、
NH4NO3等。也添加氨基酸来补充氮素。
 （2）P 是磷脂的主要成分，而磷脂又是

原生质、细胞核的重要组成部分。磷也
是ATP、ADP等的组成成分。在植物培养
过程中，向培养基内添加磷、不仅增加
养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，
增加蛋白质在植物体中的积累。常用的
物质有KH2PO4或NaH2PO4等。
 （3）K 对碳水化合物合成、转移、以及
氮素代谢等密切关系。K增加时，蛋白质
合成增加，维管束、纤维组织发达，对
胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，
一般为1—3mg/L为好。制备培养基时，
常以KCL、KNO3等盐类提供。

（4）Mg、S和Ca、Mg是叶绿素的组成成分，
又是激酶的活化剂；S是氨基酸和蛋白质的
组成成分。它们常以MgSO4•7H2O提供。用
量为1-3mg/l较为适宜；Ca是构成细胞壁的
一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破
坏有显著作用，常以CaCl2•H2O提供。
微量元素
指小于0.5mmol/L的元素，Fe，B，Mn，Cu，
Mo，Co等。
 铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化
氢等酶的组成成分。同时，它又是叶绿素形
成的必要条件。培养基中铁对胚的形成、芽
的分化和幼苗转绿有促进作用。在制作培养
基时不用FeSO4和FeCl3（因其在PH值5.2以上，
易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀），而使用
FeSO4•7H2O和Na—EDTA的结合成的结合物。
B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组
织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会
导致生长、发育异常现象。

有机化合物（organic compound）

培养基中只含有大量元素与微量元素，常
称为基本培养基（basic medium）。为不同
的培养目的往往要加入一些有机物以利于
快速生长。常加入的的有机成分要以下几
类：
碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和
果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好生
长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培
养中也有应用。蔗糖使用浓度在2%—3%，常
用3%，即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时
可用2.5%。但在胚培养时采用4%—15%的高浓
度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。
 不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻
根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖
和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组
织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规
定按量称取，不能任意取量。高压灭菌时，一
部分糖会发生分解，制订配方时要给予考虑。
在大规模生产时，可用食用的棉白糖代替。


维生素（vitamin）：这类化合物在植物细胞
里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活
动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽
然大多数的植物细胞在培养基中都能合成所
必须的维生素，但在数量上还明显不足，通
常需要加入一至数种维生素，以便获得最良
好的生长。主要有VB(盐酸硫胺素) 、VB6(盐
酸吡多醇)、VPP(烟酸)、VC(抗坏血酸)，有时
还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为
0.1—1.0mg/L。有时用量较高。VB1对愈伤组
织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进
根的生长，VPP与植物代谢和胚的发育有一
定关系。VC有防止组织变褐的作用。

肌醇（myo—inosltol）：又叫环己六醇，
在糖类的转化中起重要作用。通常可由
磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成
果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇与6分
子磷酸残基相结合形成植酸，植酸与钙、
镁等阳离子结合成植酸钙镁，植酸可进
一步形成磷脂，参与细胞膜的构建。使
用浓度一般为100mg/L，适当使用肌醇，
能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽
的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有
促进作用，对细胞壁的形成也有作用。

氨基酸（almino acide）：是很好的有机
氮源，可直接被细胞利用。培养基中最
常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨
酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬
酰胺、丙氨酸等也常用。有时应用水解
乳蛋白或水解酪蛋白，它们是牛乳用酶
法等加工的水解物，是含有20种氨基酸
的混合物，用量在10-100mg/L之间。由
于它们营养丰富，极易引起污染。如在
培养中无特别需要，以不用为宜。
天然复合物

天然复合物的成分比较复杂，大多含氨
基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它
对细胞和组织的增殖与分化有明显的促
进作用，它对器官的分化作用不明显。
它的成分大多不清楚，所以一般应尽量
避免使用。
椰乳：是椰子的液体胚乳。它是使用最
多，效果最大的一种天然复合物，一般
使用浓度在10%-20%，与其果实成熟度
和产地关系也很大，它在愈伤组织和细
胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分
生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促
进作用。
 香蕉：用量为150-200ml/L。用黄熟的小
香蕉，加入培养基后变紫色。对PH值缓
冲作用大。主要在兰花的组合培养中应
用，对发育有促进作用。

马铃薯：去掉皮和芽后，加水煮30min，再
经过滤，取滤液使用。用量为150-200g/L。
对PH值缓冲作用大。添加后可得到健壮的植
株。
 水解酪蛋白：为蛋白质的水解物，主要成分
为氨基酸，使用浓度为100—200mg/L，受酸
和酶的作用易分解，使用时应注意。
 其他：酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%).主要
成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液
（0.01%-0.5%）、苹果和番茄的果汁、黄瓜
的果实、未熟的玉米胚乳等。遇热较稳定，
大多在培养困难时使用。

植物生长调节物质（hormone）

植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化
合物，它能以极微小的量影响到植物的细
胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态
建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和
休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，
在培养基的各种成分中，植物生长物质是
培养基的关键物质，对植物组织培养起着
决定性作用。

1）生长素类（auxin）：在组织培养中，
生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，
诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生
长。在促进生长方面，根对生长素最敏
感。在极低的浓度下（10-5—10-8mg/L）
就可促进生长，其次是茎和芽。天然的
生长素热稳定性差，高温高压或受光条
件易被破坏。在植物体内也易受体内酶
的分解，组织培养中常用人工合成的生
长素类物质。
IBA（indolebutyri acid 吲哚丁酸）：是促
进发根能力较强的生长调节物质。
 2，4—D（2，4—二氯苯氧乙酸）启动能
力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的
形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形
成，影响器官的发育，适宜的用量范围
较窄，过量常有毒效应。

IAA（indo acetic acid 吲哚乙酸）：
 是天然存在的生长素，亦可人工合成，其
活力较低，是生长素中活力最弱的激素，
对器官形成的副作用小。高温高压易被破
坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受
光也易分解。
 NAA（naphthalene acetic acid 萘乙酸）：
在组织培养中的启动能力要比IAA高出3-4
倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高
压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。
NAA和IBA广泛应用于生根，并与细胞分
裂素互作促进芽的增殖和生长。


2）细胞分裂素类（cytokinin）：这类激
素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA（6-苄
基氨基嘌呤）、Kt（kinetin 激动素）、
Zt（zeatin 玉米素）等。其中Zt活性最强，
但非常昂贵，常用6-BA。
 在培养基中添加细胞分裂素有三个作用
（1）诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长
（2）促进细胞分裂与扩大
（3）抑制根的分化。
因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的
分化和茎、苗的增殖，而在生根培养中
使用较少或用量较低。

3）GA（gibberellic acid 赤霉素）：
有二十多种，生理活性及作用的种类、
部位、效应等各有不同、培养基中添加
的是GA3，主要是促进幼苗茎的伸长生长，
促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生
长素协同作用，对形成层的分化有影响，
当生长素/赤霉素比值高时有利于木质部
分化，比值低时有利于韧皮部分化：此
外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、
块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形
成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体
的生长。
激素配比模式

生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方
向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促
进芽器官的分化，应除去或降低生长素浓度，
或调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。
高 有利于根和愈伤组织形成
生长素/细胞分裂素
{
中 有利于芽的分化
低 有利于芽的形成

生长调节物质的使用甚微，一般用mg/L
表示浓度。在组织培养中生长调节物质
的使用浓度，因植物的种类、部位、时
期、内源激素等的不同而异，一般生长
素浓度的使用为0.05%-5mg/L，细胞分裂
素的浓度0.05-10mg/L。

抗生物质（antibiotic）

抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量
在5-20mg/L之间。

添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料
的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成
百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约
人力、物力和时间。尤其对大量通气长期培养，
效果好。对于刚感染的组织材料，可向培养基中
注入5%-10%的抗菌素。抗生素各有其抗菌谱，要
选择加以利用，也可两种抗生素混用。
但是应当注意抗生素对植物组织的生长
也有抑制作用，可能有些植物适宜用青
霉素，而另一些植物却不适应。
 值得一提的是，在工作中不能以为有了
抗生素，而放松灭菌措施，此外，在停
止抗生素使用后，往往污染率显著上升，
这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来。

 活性碳（active

carbon）
活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结
构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，
它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附
力越强。温度低吸附力强，温度高吸附力弱，甚
至解吸附。通常使用浓度为0.5—10g/L。它可以
吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂
中所含的杂质，培养物分泌的酚、琨类物质以及
蔗糖在高压消毒只产生的5—羟甲基糖醛及激素
等。






活性炭作用：
茎尖初代培养，可以吸附外植体产生的致死性
褐化物。
活性炭在生根时有明显促进作用。其机理一般
认为与活性炭减弱光照有关。
在培养基中加入0.3%的活性炭，还可降低玻璃
苗的产生频率。
活性炭在胚胎培养中也有一定作用，可减少组
织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。
但是，活性炭有副作用，研究表示，每毫克活
性炭吸附100mg左右的生长调节物质，这说明
只要极少量的活性炭就可以完全吸附培
养基的调节物质。
 大量活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，
因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也
易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻
摇动培养瓶。总之，在使用时要有量的
意识，不能随意添加，使活性炭发挥其
积极作用。

二 .培养材料的支持物

琼脂（agar）：在固体培养时琼脂是最好
的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的
高分子碳水化合物，本身并不提供任何
营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，
冷却至40ºC即凝固为固体溶胶。通常所
说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解
于90ºC以上的热水。琼脂的用量在610g/L之间，若浓度太高，培养基就会变
得很硬，营养物质难以扩散到培养的组
织中去。若浓度太低，凝固性不好。新
买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。
一般

琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上
品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的
加工方式有关外，还与高压灭菌时的温
度、时间、PH值等因素有关。长时间的
高温会使凝固力下降，过酸过碱会加之
高温会使琼脂发生水解，丧失凝固力。
时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝
固能力。
 三、环境条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度等
各种环境条件，培养基组成、pH值、渗
透压等各种化学环境条件都会影响组织
培养育苗的生长和发育。
温度(temperature)

因为温度是植物组织培养中的重要因素，所以植物
组织培养在最适宜的温度下生长分化才能表现良好，
大多数植物组织培养都是在23～27℃之间进行，一
般采用25± 2℃。低于15℃℃时培养，植物组织会
表现生长停止，高于35℃时对植物生长不利。但是，
不同植物培养的适温不同，百合的最适温度是20℃、
月季足25-27℃、番茄是28℃。温度不仅影响植物组
织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器
官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28℃为最好，
在120℃以下，33℃以上形成率皆最低。

不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞
片在30℃以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分
率都比在25℃以下的高。桃胚在2—5℃条件进
行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成
活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3—5d，
可得到无病毒苗。
光 照
(light)

组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光
质、以及光照时间方面

1．光照强度(light intensity)

光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目
前的研究情况看，光照强度对外植体及细胞的最初分裂有明
显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而
光照强度较弱幼苗容易徒长。

2．光质(light wave)

光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有
明显的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈
伤组织。生长旺盛，而白光下幼苗纤细。

但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐
菖蒲子球块接种15d后，在蓝光下培养首先出现
芽，形成的幼苗

3．光周期(light period)

试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织
培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。
研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在
短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，
有时需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在
暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织
湿度 (humidity)

湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件，
容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。
前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂
用量，否则，将使培养基干硬，以致不利于外植体
接触或插进培养基，导致生长发育受阻。封口材料
直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材
料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影
响。

环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，
一般要求70%—80%的相对湿度，常用加湿器或
经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培
养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度
的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的
正常进行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造
成污染。
渗透压(penetrating pressure)

培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化
合物，因此，而影响到渗透压的变化。
通常1—2个大气压对植物生长有促进作
用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍
作用，而5—6个大气压植物生长就会完
全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。
pH值 (pH value)
不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的
(表2—1)，大多在5、6．5左右，一般培养基皆
要求5.8，这基本能适应大多植物培养的需要。
 pH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。
以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样，后
者较高一些。一般来说当pH值高于6．5时，培养
基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因
为高温灭菌会降低pH值(约0.2—0.3个pH值)因此
在配制时常提高pH值0．2—0．3单位。pH值大小
调整可用0．1M的NaOH和0．IM的HCI来调整。lml
的NaOH可使pH值升高0．2单位，lml的HCl可使pH
值降低0．2单位。调节时一定要充分搅拌均匀。

不同植物的最适pH值
种类
最适pH值
种类
最适pH值
杜鹃
4.0
月季
5.8
越桔
4.5
胡萝卜、石刁柏
6.0
蚕豆
5.5
桃
7.0
番茄
5.7
氧气(oxygen)

氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封
闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜
的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶
口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引
起污染。固体培养基可加进活性炭来增
加通气度，以利于发根。培养室要经常
换气，改善室内的通气状况。液体振荡
培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，
同时要考虑容器的类型、培养基等
第三节 培养基的制备

一、母液(stock solution)的配制和保存

在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的
工作。为简便起见，通常先配制一系列母液，即贮
备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可
以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，
而且还便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高
10-100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量
元素、铁盐、有机物和激素类等。配制时注意一些
离子之间易发生沉淀，如Ca2+和S042+，Ca2+、

Mg2+和PO43- 一起溶解后，会产生沉淀，一定
要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸
馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学
纯或分析纯。药品的称量及定容都要准确。各
种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混
合。一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维
生素等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别
配制，也可以混在一起。母液配好后放人冰箱
内低温保存，用时再按比例稀释。
母液的配制方法：

单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定
浓度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含
有a毫克溶质。

混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定
倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一
定体积配成混合母液，浓度可用a mg/L表示，即配
制一升培养基吸取该母液a ml.

生长素配制时可先用少量95%酒精助溶。2，4—D可
用O．1mol／L的NaOH或KOH助溶，加入温水定容。
生长素常配成1mg／ml的溶液贮于冰箱中备用。

细胞分裂素类一般先用少量1N盐配溶解后，再
加入温水冷却后定容，

铁盐配法（MS为例）：在装有400ml 蒸馏水
的烧杯中加入2粒苛性钠，溶解后加入3.73g
EDTA-Na2，加热使其全部溶解，然后边搅拌边
慢慢加入2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解，冷
却后定容至500ml，置于冰箱中备用。
第四节 培养基的选择

在建立一个新的实验体系时，为了能研
制出一种适合的培养基，最好先由一种
已被广泛使用的基本培养基(如Ms培养基
或B5培养基)开始。当通过一系列的实验，
对这种培养基做了某些定性和定量的小
变动之后，即有可能得到一种能满足实
验需要的新培养基，选择最佳培养基。
常用试验方法主要有单因子试验、多因
子试验及广谱实验等。
一、单因子试验

在单因子试验中．由于培养基中其他成分都维
持在一般水平上，所以只变动一个因子，就可
以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。
例如Ms基本培养基的其他成分和用量都不变，
只变动NAA用量对某一培养物生根的影响，这种
只研究一个因素的试验就是单因子试验。

生物学试验不同于物理学或化学试验，最显著
的差别是在生物学试验中必需设置对照组与试
验组，试验组可以有一组或几组，随试验的复
杂性而设置，对照组也可能有一组以上。
试验中要求对照组与试验组中的试验个体，
即植物组织块或其他培养物，必须在遗传
性、生理状态、前培养条件等方面，尽可
能完全一致。以保证试验结果是来源于试
验因子，而不是由于试验材料的不一致导
致的。
 试验中各处理一般都要设有一定的重复，
以取得可靠的试验结果。随试验规模和要
求不同，大多每个项目要有4—10瓶，每瓶
至少3块培养物或3丛小幼苗。

二、多因子试验
 对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试
验称为多因子实验，试验可采用完全试验方案，
也可选用正交设计方案，完全试验方案具有均
衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭
配，构成了所有可能的处理组合，如研究NAA和
6—BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度
水平(0，0.5，2.5，5，10mg／L)，这两种因子
各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项
处理的试验见下表：
2种激素5种浓度的实验组合
6-BA
mg/L）
0
0.5
2.5
5
1
0
NAA
0
1
2
3
4
5
(mg/L)
0.5
6
7
8
9
10
2.5
11
12
13
14
15
5
16
17
18
19
20
10
21
22
23
24
25

完全试验方案试验因子越多，处理数越多，
试验越复杂，消耗的精力、物力越多。为了
减少试验处理，但又能准确全面地获得试验
信息，通常采用正交试验。例如，采用正交
设计，在使用此表时就可以安排4个因子，3
种水平的试验，一共做9种不同搭配的试验，
其结果相当于做了27次种种搭配的试验。正
交试验虽然是多因素搭配在一起的试验，但
是在试验结果的分析中，每一种因素所
起的作用却又能够明白无误地表现出来。
因此，一次系统的试验结果，就可以把
问题分析得清清楚楚，用有限的时间取
得成倍的收获。在组织培养研究中，可
用于同时探求培养基中适宜的几种成分
的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和
其他成分的用量。
三、逐步添加和逐步排除的
试验方法

在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得
可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营
养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以
逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试验成
功，在逐步减少时是缩小范围，以便找到最有
影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使
培养基简化，以降低成本和利于推广。在寻求
最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的
简单方法。
四、广谱实验法
在广谱实验法中，把培养基中所有组分
分为4大类：
 无机盐
 有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)
 生长素
 细胞分裂素
对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高
(H)3个浓度,4类物质各3种浓度的自由组


合即构成了一项包括81个处理的实验。
在这81个处理中最好的一个可用4个字母
表示,例如，一个包含中等浓度无机盐，
低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素
和高等浓度有机营养物质的处理即可表
示为MLMH。达到这个阶段，再试用不同
类型的生长素和细胞分裂素即可找到培
养基的最佳配方。这是因为不同类型的
生K素和细胞分裂素对不同植物的活性有
所不同。
第二章 外植体的选择及灭菌
第一节 外植体的选择
 泛指第一次接种所使用的植物组织、器
官等一切材料。如，顶芽、茎段、叶片
等。
 （一）.外植体的选择：
 一. 部位：不同的植物、器官和组织其形
态发生能力很不相同。在组培中，选择
合适的，最易表达全能性的部位，是决
定组培系成功建立的前提之一。

在选择植物外植体进行组织培养时，还
要考虑待培养材料的来源是否保证，是
否容易成苗；同时要考虑到该外植体，
特别是经过脱分化产生的愈伤组织，是
否会引起不良变异，丧失原品种的优良
性状。
 茎尖：对大多数植物来讲，茎尖是较好
的部位，由于其形态已经基本建成，生
长速度快，遗传性稳定，也是获得无病
毒苗的重要途径，但茎尖易受到材料来
源的限制，而采用茎段（一般木本植物、
较大的草本植物）可解决培养材料的不
足。

叶片：由于叶片的来源最有保证，因而
许多植物的组织培养以叶片为起始培养
物，如，玫瑰、海棠、矮牵牛和豆瓣绿
等许多植物。
 子叶或下胚轴：对一些培养较困难的植
物，则往往可以通过其子叶或下胚轴来
建立其组织培养体系。
 若有可能，最好对培养较困难的植物各
部位的诱导及分化能力进行比较，从中
筛选出最佳外植体。

二. 取材季节：
 对大多数植物而言，应在生长开始的季
节采样较好，若在生长末期或已进入休
眠期时取样，则外植体可能对诱导反应
迟钝或无反应。在母株生长旺盛的季节
取材料，不仅成活率高而且增殖率也大。
如，马铃薯在12月和4月所取的外植体具
有强烈的再生能力。而2~3月间或5~11月
间所取的材料，则很少能够再生。

三. 生理年龄：
 按照生理学基本观点，沿植物体主轴，
越向上的部位所形成的器官其生长时间
越短的，其生理年龄也相应越老，越接
近发育上的成熟，越易形成花器官。反
之，越向基部，其生理年龄越小，幼年
的组织都比老年的组织具有较高的形态
发生能力。植株下部组织产生营养芽的
比例高，而上部组织产生花器官的比例
高。因此，外植体的采集尽量选用植物
体最幼态的组织。

四. 外植体的大小：
 外植体越大，污染率越高，但也不能过
小，越小成活率越低。在通常情况下，
叶片、花瓣等的面积约为5mm²，茎段为
0.5cm²，除非是用于去除病毒，否则不宜
将外植体切得过小。

第二节

灭菌
灭菌是组织培养重要的工作之一。初学
者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌
的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，
接触自然水源的物体，至少它的表面都
是有菌的。依此观点，无菌室等未经处
理的地方、超净台表面、简单煮沸的培
养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、
我们身体的整个外表及与外界相连的内
表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼
出的气体、培养容器无论洗得多干净等
等都是有菌的。
这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻
类及其他微生物。茵的特点是：极小，肉眼看
不见。无处不在，无时不有，无孔不人。在自
然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖
力极强，条件适宜时便可大量滋生。
 无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过
后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处
理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效
的)。高层大气、岩石内部、健康的动、植物的
不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元
素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以
上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世
界小得多。


菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和
孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命
的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，
它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之
不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌
芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即由
于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生
物，所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超
净台、等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和
手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下
进行的操作，就叫做无菌操作。
一. 灭菌方法
 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的
两类，即：物理方法如干热(烘烧和灼烧)、
湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外
线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量
无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升
汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏
儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精
化学药品处理。这些方法和药剂要根据
工作中的不同材料不同目的适当选用。


湿热灭菌（培养基）
培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌
的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外
溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而
锅内温度也随之增加。在o．1MPa的压力下，锅
内温度达121℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死
各种细菌及其高度耐热的芽孢。
 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，
灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，
但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证
灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，
待压力上升到O．05MPa时，打开放气阀，放出空
气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀
再通电后，压力表上升达到0．1MPa时压力0．10．15MPa，20min。


对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、
接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养
基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止
培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时
间。

对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭
菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌
20-30min。

高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2-0.3单位。
高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多种因
素。在高压灭菌前用碱调高pH值至预定值的则相反。
培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度
物质时，高压灭菌后的pH值变化幅度较大，甚
至可大于2个pH值单位。环境pH值的变化大于
0.5单位就有可能产生明显的生理影响。

高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，
从而改变培养基的渗透压。在8%-20%蔗糖范围
内，高压灭菌后的培养基约升高0．43倍。

培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，
可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培
养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中添
加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，
添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。
防止高压灭菌培养基变化的方法：

(1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养
基成分的资料，及时采取有效措施。
 (2)设计培养基配方时尽量采用效果类似
的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使
用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替
IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注
意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影
响等。

(3)配制培养基时应注意成分的适当分组
与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最
后加入。
 (4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及
回复动态。如高压灭菌后的pH值常由
5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左
右。这样在实验中就可以根据这一规律
加以掌握。
灼烧灭菌（用于无菌操作的器械

）
在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀
等浸入95%的酒精中，使用之前取出在
酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即
使用。操作中可采用250或500ml的广口
瓶，放入95%的酒精，以便插入工具

干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）

干热灭菌是利用烘箱加热到160-180~C的温度来
杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细
胞的抗热性大为提高，接近芽抱的抗热水平，通
常采用170℃持续90min来灭菌。干热灭菌的物品
要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭
菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。
灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。
烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热
对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，
才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热
灭菌能源消耗太大，浪费时间。
过滤灭菌（不耐热的物质
）
一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸
和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处
理，通常采用过滤灭菌方法。
 防细菌滤膜的网孔的直径为0.45μm以下，当溶
液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因
大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体
量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注
射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射
器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，
推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压
出的溶液就是无菌溶液。


紫外线和熏蒸灭菌（空间）
(1)紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种
箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因
子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发
生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死
亡。紫外线的波长为200—300nm，其中以
260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿
透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表
面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为
宜。
 (2)熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使
化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死
空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只
需要把消毒的空间关闭紧密即可。


常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按
5—8ml／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加
5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷
湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效
果不如甲醛。
化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋
白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，
增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。
一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果
越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥
作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。
还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越
强，但石炭酸和酒精例外。
喷雾灭菌（物体表面）

物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。
如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，
可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的
来苏儿溶液以及0.25%—1%的新洁尔灭
也可以。
消毒剂灭菌（用于植物材料表面）
 从外界或室内选取的植物材料，都不同
程度地带有各种微生物。这些污染源一
旦带人培养基，便会造成培养基污染。
因此，植物材料必须经严格的表面灭菌
处理，再经无菌操作手续接到培养基上，
这一过程叫做接种。


第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，
将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等
刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能
放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至
数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂
浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水
冲洗在污染严重时特别有用。
洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣
粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，
除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，
最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温。
 第二步 是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接
种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、
消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。
由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之
70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润
时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、
包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，
以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍
长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸
发后再剥除外层，取用内部材料。

第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较
多，可根据情况选取1—2种使用见表。
常用灭菌剂使用浓度及效果比较表
使用浓度(%)
持续时间
（min）
去除的难易
效果
次氯酸钙
9~10
5~30
易
很好
次氯酸钠
2
5~30
易
很好
氯化汞
0.1~1
5~8
较难
最好
抗菌素
4~50mg/L
30~60
中
较好
灭菌剂
上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期
内贮用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生
氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升
汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是
分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的
影响较小，灭菌后用无菌水涮洗3—4次即可；由
于用升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒较难去
除，所以应当用无菌水涮洗8～10次，每次不少
于3min，以尽量去除残毒。
 灭菌时，把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器
皿中，记好时间，倒人消毒溶液，不时用玻璃棒
轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接
触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前
1—2min，开始把消毒液倾人一备好的大烧杯内，
要注意勿使材料倒出，倾净后立即

倒入无菌水，轻搅涮洗。灭菌时间是从倒人消毒
液开始，至倒入无菌水时为止。记录时间还便于
比较消毒效果，以便改正。灭菌液要充分浸没材
料，宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏
小的容器中使用很多材料灭菌。
 在灭菌溶液中加吐温—80或Tnton X效果较好，
这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，
更容易浸人到灭菌的材料表面。但吐温加人后对
材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌
时间，一般加入灭菌液的O.5%，即在100ml加入
15滴。
 最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，
视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。无菌水
涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。

第三章 外植体的接种培养及驯化
第一节

接
种
接种时由于有一个敞口的过程，所以是
极易引起污染的时期，这一时期主要由
空气中的细菌和工作人员本身引起，接
种室要严格进行空间消毒。接种室内保
持定期用1%—3%的高锰酸钾溶液对设备、
墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用
紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间
用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空
气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按
以下步骤进行：

(1)在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯
进行灭菌；
 (2)在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的
紫外灯；
 (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并
换穿拖鞋等；
 (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。
然后擦拭工作台面；
 (5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头
至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过
火烤干；
 (6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、
走动和咳嗽等；
 (7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌
30min。
 若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
具体的接种操作：
 (1)将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台
上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水
分，取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。
 (2)材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，
对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm见方的小
块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含
l—2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼
烧接种器械，防止交叉污染。
 (3)用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放
置到培养基上。具体操作过程是：先解开包口纸，
将试管几乎水平拿着，使试管囗靠近酒精灯火焰，


并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数
秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，
去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一
块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基。
若是叶片直接附在培养基上，以放1—3块为宜。
至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端
向上)外，其他尚无统一要求。放置材料数量
现在倾向少放，通过统计认为：对外植体每次
接种以一支试管放一枚组块为宜，这样可以节
约培养基和人力，一旦培养物污染可以抛弃，
接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。并
用棉塞，塞好后，包上包口纸，包囗纸里面也
要过火。
第二节

培养和驯化
指把培养材料放在培养室(有光照、温度
条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈
伤组织或进一步分化成再生植株的过程。
一、培养方法
(1)固体培养法
即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是
现在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行，
但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化
中毒现象发生。
 (2)液体培养法
即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方
法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通
过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，
采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度
一般为50-100r／min，这种定期浸没的方法，既
能使培养基均一，又能保证氧气的供给。

二、培 养 步 骤

1 . 初代培养
初代培养旨在获得无菌材料和无性繁
殖系。即接种某种外植体后，最初的几
代培养。初代培养时，常用诱导或分化
培养基，即培养基中含有较多的细胞分
裂素和少量的生长素。初代培养建立的
无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体
和原球茎等。根据初代培养时发育的方
向可分为：
1)顶芽和腋芽的发育

采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋
芽的休眠侧芽启动生长，从而形成 一个微型的多
枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这
种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽——苗增殖
的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分
嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤
中去的完整的小植株。一些木本植物和少数草本植
物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、
茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微
型扦插，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最
能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。

适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采
用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子
萌发后取枝条也可以。

茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。
它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外
植体进行接种。在实际操作中，采用包括茎尖
分生组织在内的一些组织来培养，这样便保证
了操作方便以及容易成活。

用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，
有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，
如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也
会生出不定芽，形成芽丛。
2)不定芽的发育

在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经
脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。然后，经
再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它
在构成器官的纵轴上表现出单向的极性(这与
胚状体不同)。多数情况下它先形成芽，后形
成根。

另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些
植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮
牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条
件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连
续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的
能力被大大地激发起来。许多种类的外植体表
面几乎全部为不定芽所覆盖。
在许多常规方法中不能无性繁殖的种类，
在试管条件下却能较容易地产生不定芽
而再生，如柏科，松科，银杏等一些植
物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地
发生不定芽，用臼合鳞片的切块就可大
量形成不定鳞茎。
 在不定芽培养时，也常用诱导或分化培
养基。用靠培养不定芽得到的培养物，
一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草
莓等。

3)体细胞胚状体的发生与发育

体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不
同，它也通过球形、心形、鱼雷形和子
叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。
但它是由体细胞发生的。胚状体可以从
愈伤组织表面产生，也可从外植体表面
已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的
细胞中产生，也可从外植体表面已分化
的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中
产生。
2
继代培养

在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体
和原球茎等，数量都还不多，它们需要进一步
增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优
势。

继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁
培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最
后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后
代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基
础，那么经10代将生成210株苗。

继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分
离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。切割
茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培
养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。
培养基常是MS0基本培养基；分离芽丛适于由
愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养
基。若芽丛的芽较小，可先切成芽丛小块，
放人MS0培养基中，待到稍大时，再分离开来
继续培养。

增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎
完全相同．由于培养物在接近最良好的环境条
件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物
的竞争，所以能够按几何级数增殖；；

在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，
而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在
达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分
转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是贮
备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出
成品。
3 培养过程中常出现的问题及解决方法
初代培养外植体的褐变

外植体褐变是指在接种后，其表面开始
褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的
现象。它的出现是由于植物组织中的多
酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生
变化所致。在褐变过程中，会产生醌类
物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养
基后，就会抑制其他酶的活性，从而影
响所接种外植体的培养。
褐变的主要原因
①植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现
象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异，因
此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，
而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。
因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品
种分别进行处理。
 ②生理状态 由于外植体的生理状态不同，所以
在接种后褐变程度也有所不同。一般来说，处于
幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年
的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因
此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种
后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐
变程度较为严重。

③培养基成分 浓度过高的无机盐会使
某些观赏植物的褐变程度增加，此外，
细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外
植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变
现象加深。
 ④培养条件不当 如果光照过强、温度
过高、培养时间过长等，均可使多酚氧
化酶的活性提高，从而加速被培养的外
植体的褐变程度。

减轻褐变现象发生的方法
①选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长
处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减
轻。
 ②合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质
水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料
的褐变现象。
 ③使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、
抗坏血酸、PVP等抗氧化剂能够较为有效地避免
或减轻很多外植体的褐变现象。另外，使用0.1%0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。
 ④连续转移 对容易褐变的材料可间隔12~24h的
培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续
处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

继代培养时材料的玻璃化
实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，
有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，
这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗
生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗
的生理失调症。
 因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使
繁殖系数大为降低。在不同的种类、品种间，试
管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞
分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在
培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能
够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。呈现玻
璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极
性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作








用强，无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培
养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具
体解决的方法为：
①增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的
水势；
②减少培养基中含氮化合物的用量；
③增加光照；
④增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减
轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；
⑤降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻
试管苗玻璃化的现象发生；
⑥降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加
入适量脱落酸。
4 生根培养

当材料增殖到一定数量后，就要使部分
培养物分流到生根培养阶段。若不能及
时将培养物转到生根培养基上去，就会
使久不转移的苗子发黄老化，或因过分
拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。根
培养是使无根苗生根的过程，这个过程
目的是使生出的不定根浓密而粗壮。生
根培养可采用1／2或者1/4MS培养基，全
部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长
素(NAA、IBA等)。
诱导生根方法：
①将新梢基部浸入50或100×10-6I IBA溶液
中处理4—8h；②在含有生长素的培养基中
培养4-6d；③直接移入含有生长素的生根
培养基中。上述三种方法均能诱导新梢生
根，但前二种方法对新生根的生长发育则
更为有利。而第三种对幼根的生长有抑制
作用。其原因是当根原始体形成后较高浓
度生长素的继续存在，则不利于幼根的生
长发育。不过这种方法比较可行。
 另外也可采用下列方法就可生根：
 ①延长在增殖培养基中的培养时间；

②有意降低一些增殖倍率，减少细胞分
裂素的用量(即将增殖与生根合并为一
步)；
 ③切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根，
此方法则没有生根阶段。可以省去一次
培养基制作，切割下的插穗可用生长素
溶液浸蘸处理，但这种方法只适于一些
容易生根的作物。
 另外少数植物生根比较困难时，则需要
在培养基中放置滤纸桥，使其略高于液
面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从
而诱发生根。

从胚状体发育成的小苗，常常有原先已分
化的根，这种根可以不经诱导生根阶段而
生长。但因经胚状体途径发育的苗数特别
多，并且个体较小，所以也常需要一个低
浓度或没有植物激素的培养基培养的阶段，
以便壮苗生根。
 试管内生根壮苗的阶段，为了成功地将苗
移植到试管外的环境中，以使试管苗适应
外界的环境条件。通常不同植物的适宜驯
化温度不同。如菊花，以18～20℃为宜。

实践证明植物生长的温度过高不但会牵涉到蒸
腾加强。而且还牵涉到菌类易滋生的问题。温
度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活。春季低
温时苗床可加设电热线，使墓质温度略高于气
温2～3℃，这不但有利于生根和促进根系发达，
而且还有利于提前成活。

移植到试管外的植物苗光强度应比移植前
培养有所提高，并可适应强度较高的漫射光，
(约4000h左右)，以维持光合作用所需光照强
度。但光线过强刺激蒸腾加强，会使水分平衡
的矛盾更尖锐。

三、试管苗移栽驯化
试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，这个工
作环节做不好，就会造成前功尽弃。为了做好试
管苗的移栽，应选择合适的基质，并配合以相应
的管理措施，才能确保整个组织培养工作的顺利
完成。

试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照
和温度近100%的相对湿度环境条件下生长的，因
此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的正
常小苗有着很大的差异。所以必须通过炼苗，例
如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们
逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织
上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只
有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。


从叶片上看，试管苗的角质层不发达，叶片通
常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛，甚至叶片
上出现了大量的水孔，而且，气孔的数量、大
小也往往超过普通苗。由此可知，试管苗更适
合于高湿的环境生长，当将它们移栽到试管外
环境时，试管苗失水率会很高，非常容易死亡。
因此，为了改善试管苗的上述不良生理、形态
特点，则必须经过与外界相适应的驯化处理另
外，对栽培驯化基质要进行灭菌，因为试管苗
在无菌的环境中生长，对外界细菌、真菌的抵
御能力极差。为了提高其成活率，在培养基质
中可掺入75%的百菌清可湿性粉剂200-500倍液，
以进行灭菌处理。 ，通常采取的措施有：对外
界要增加湿度、减弱光照；对试管内要通透气
体、增施二氧化碳肥料、逐步降低空气湿度等。

一. 移栽用基质

适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性
和一定的肥力，容易灭菌处理，并不利于杂菌滋
生的特点，一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。
为了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐
殖土。配时需按比例搭配，一般用珍珠岩，蛭石，
草炭土或腐殖土比例为1:1:0.5。也可用砂子：草
炭土或腐殖土为1:1。这些介质在使用前应高压灭
菌。或用至少3h烘烤来消灭其中的微生物。要根
据不同植物的栽培习性来进行配制，这样才能获
得满意的栽培效果。以下介绍几种常见的试管苗
栽培基质。

(1)河砂:河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂
即平常所说的河砂，其颗粒直径为1—2mm。细
砂 即 通 常 所 说 的 面 砂 ， 其 颗 粒 直 径 为 0.1—
0.2mm。河砂的特点是排水性强，但保水蓄肥
能力较差，一般不单独用来直接栽种试管苗。

(2)草炭土:草炭土是由沉积在沼泽中的植物残
骸经过长时间的腐烂所形成，其保水性好，蓄
肥能力强，呈中性或微酸性反应，但通常不能
单独用来栽种试管苗，宜与河砂等种类相互混
合配成盆土而加以使用。

(3)腐殖土:腐殖土是由植物落叶经腐烂所形
成。一种是自然形成，一种是人为造成，人
工制造时可将秋季的落叶收集起来，然后埋
人坑中，灌水压实令其腐烂。第二年春季将
其取出置于空气中，在经常喷水保湿的条件
下使其风化，然后过筛即可获得。腐叶上含
有大量的矿质营养、有机物质，它通常不能
单独使用。掺有腐殖土的栽培基质有助于植
株发根。
二. 移栽前的练苗
 移栽前可将培养物不开口移到自然光照
下锻炼2—3d，让试管苗接受强光的照射，
使其长得壮实起来，然后再开口练苗1—
2d，经受较低湿度的处理，以适应将来
自然湿度的条件。

三. 移栽和幼苗的管理
 从试管中取出发根的小苗，用自来水洗
掉根部粘着的培养基，要全部除去，以
防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，
应避免造成伤根。栽植时用一个筷子粗
的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗
插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后
把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。
栽后轻浇薄水。再将苗移入高湿度的环
境中。保证空气湿度达90%以上。

(1)保持小苗的水分供需平衡
 在移栽后5-7d内，应给予较高的空气湿度条件，
使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条
件，让小苗始终保持挺拔的状态。保持小苗水
分供需平衡首先营养钵的培养基质要浇透水，
所放置的床面也要浇湿，然后搭设小拱棚，以
减少水分的蒸发，并且初期要常喷雾处理，保
持拱棚薄膜上有水珠出现。当5—7d后，发现
小苗有长趋势，可逐渐降低湿度，减少喷水次
数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较
小的条件。约15d以后揭去拱棚的薄膜，并给
予水分控制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗
壮。

(2)防止菌类滋生
 由于试管苗原来的环境是无菌的，移出来以后
难以保持完全无菌，因此，应尽量不使菌类大
量滋生，以利成活。所以应对基质进行高压灭
菌或烘烤灭菌。可以适当使用一定浓度的杀菌
剂以便有效地保护幼苗，如多菌灵、托布津，
浓度800—1000倍，喷药宜7—l0d一次。在移
苗时尽量少伤苗，伤口过多，根损伤过多，都
是造成死苗的原因。喷水时可加入0.1%的尿素，
或用1／2MS大量元素的水溶液作追肥，可加快
苗的生长与成活。

(3)一定的温、光条件
 试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜
的生根温度是18—200C，冬春季地温较低时，
可用电热线来加温。温度过低会使幼苗生长迟
缓，或不易成活。温度过高会使水分蒸发，从
而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。
 另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在
小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤
小苗和增加水分的蒸发。当小植株有了新的生
长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光
照。促进光合产物的积累，增强抗性，促其成
活。

(4)保持基质适当的通气性
 要选择适当的颗粒状基质，保证良好的通气作
用。在管理过程中不要浇水过多，过多的水应
迅速沥除，以利根系呼吸。
 综上所述，试管苗在移栽的过程中，只要把水
分平衡、适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、
温条件控制好，试管苗是很容易移栽的。

第四章 愈伤组织的培养

植物的脱分化形式有两种，器官发生型
和胚胎发生型，在有些情况下，再分化
可以直接发生于脱分化的细胞中，无须
经历愈伤组织阶段，但大多数情况下，
再分化过程是在愈伤组织细胞中发生的。
一． 愈伤组织形成的条件

虽然如全能性所言，发育和分化过程并不导致
细胞全能性的丧失，但是，在一个完整的植物
中，每个分化细胞都是某个器官和组织中的一
个成员，它只能在与其周围成员相互协调和彼
此制约当中，恰如其分地发挥整个植株所赋予
它的一定的功能，而不具备施展其全能性的外
部条件。然而，这些细胞若是一旦脱离了母体
植株，摆脱了原来所受到的遗传上的控制和生
理上的制约，在不定期下的培养条件下，就会
发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为
分生细胞，实现脱分化过程。然后，这些脱分
化细胞经过连续的有丝分裂，形成愈伤组织
（离体隔离）。

大量研究表明，几乎所有高等植物的各种器官，
如根、茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、
茎髓和形成层等，离体后在适当条件下，都能
产生愈伤组织。由此可见，愈伤组织诱导的成
败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培
养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。当
然，外植体的类型和外植物体原来在植株上所
处的位置（反映了内源激素水平）对愈伤组织
诱导的影响也不能忽视。
二．愈伤组织形成的过程

外植体中已分化的活细胞，在外源激素
的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，
这一过程被大致划分为三个时期（诱导
期、分裂期和形成期）。
诱导期：细胞分裂的准备期
 诱导期是细胞准备进行分裂的时期。接
种的外植体材料的细胞通常都是成熟细
胞，处于静止状态，细胞大小没有多大
变化，外观无明显特征，但细胞内物质
代谢旺盛，王凯基等（1981）在研究离
体培养的油橄榄茎段时发现，细胞内合
成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核
体积明显增大。
 诱导期的长短，因植物种类和外植体的
生理状况和外部因素而异，如胡萝卜的
诱导期要好几天，新鲜的菊芋块茎则只
要22h，但菊芋块茎经过5个月的贮藏后，
诱导期则须延长到40h以上。

分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时
期
 分裂期是指细胞通过一分为二的分裂，不
断增生子细胞的过程。外植体的细胞一旦
经过诱导，其外层细胞开始迅速分裂，使
细胞脱分化。分裂期主要表现如下：
 1.细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养7
天后，细胞数可增加10倍。
 2.每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞
鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。

3.细胞体积小，内无液泡，如同根尖和
茎尖的分生组织细胞特性。
 4．细胞的核和核仁增大到最大
 5. 细胞中RNA含量减少，而DNA含量保
持不变。
 6. 随着细胞不断分裂和组织生长，细
胞的总干重、蛋白质和 核酸含量大大增
加，新细胞壁的合成极快
 总之，分裂期的愈伤组织的共同特征是：
细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的
结构，维持其不分化的状态。

形成期：从愈伤组织到器官发生
 形成期是指外植体经过诱导期和分裂期
后形成了无序结构的愈伤组织的时期。
进入形成期后，细胞的平均大小相对稳
定，不再减少，细胞分裂由原来局限在
组织外缘的平周分裂转为组织内部较深
层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片
状的拟分生组织（meristemoid），称做
分生组织结节。


分生组织结节可以成为愈伤组织的生长
中心，或者进一步分化为维管组织结
节——由分生组织结节外围的细胞作平
周分裂成为形成层状细胞，并形成了部
分维管组织如管胞、纤维细胞等，但不
形成维管系统。由于此期细胞分裂已基
本停止，细胞内发生生理代谢等的变化
而开始形成一些不同形态和功能的细胞，
因此有人又将此期称为分化期。
三. 愈伤组织的继代培养

脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了
愈伤组织，愈伤组织在培养基上生长一
段时间以后，由于营养物质枯竭，水分
散失，以及代谢产物的积累，必须转移
到新鲜培养基上培养。这个过程叫做继
代。通过继代培养，可使愈伤组织无限
期地保持在不分的增殖状态。然而，如
果让愈伤组织留在原培养基上继续培养
而不继代，它们则不可避免地发生分化，
产生新的结构。
四.
愈伤组织的生长
一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与
琼脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细
胞增殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。它
是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果。
 愈伤组织之间的质地有显著不同，有的很松脆，
有的很坚实，且这两类愈伤组织可互相转变。
其方法是：加入高浓度的生长物质，可使坚实
的愈伤组织变为松脆。反之，减低或除去生长
物质，则松脆的愈伤组织可以转变为坚实。松
脆愈伤组织都有大量的分生组织上中心，进行
活跃的细胞分裂，为大而未分化的细胞所分开；
而不脆的坚实的愈伤组织很少分化，大都是高
度液泡化的细胞。

脆的愈伤组织是进行悬浮培养最适合的材料，
稍经机械振荡，即可使组织分散成单细胞或少
数几个细胞组成的小细胞团。在培养中细胞产
生迅速增殖，而坚实的愈伤组织中的细胞间被
果胶质紧紧地粘着，因而往往不能形成良好的
悬浮系统。
 愈伤组织的质地不同是由其内部结构上的差异
所引起的。坚实致密的愈伤组织内无大的细胞
间隙，而由管状细胞组成维管组织；松脆愈伤
组织内有大量的细胞间隙，细胞排列毫无次序。
 生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有
光泽，也有淡绿色或绿色的；老化的愈伤组织
多转变为黄色甚至褐色。

外植体的脱分化因植物种类和器官及其
生理状况而有很大差别，如烟草、胡萝
卜等脱分化较易，而禾谷类的脱分化较
难；花器脱分化较易，而茎叶较难；幼
嫩组织脱分化较易，而成熟的老组织较
难。
 一个多细胞外植体通常包含着各种不同
类型的细胞，因此，由它所形成的愈伤
组织也是异质性的，其中不同的组分细
胞具有不同的形成完整植株或器官的能
力，即不同的再分化能力。


以上对愈伤组织形成过程的时期的划分
并不具有严格的意义，实际上，特别是
分裂期和形成期往往可以出现在同一块
组织上。另外，有一些研究者曾反复指
出的，虽然细胞脱分化的结果在大多数
情况下是形成愈伤组织，但这绝不意味
着所有的细胞脱分化的结果都必然形成
愈伤组织。相反，脱分化后可直接分化
为胚性细胞而形成体细胞胚。
五. 愈伤组织的形态发生方式
愈伤组织分生细胞团可进行再分化，即进行形态
建成，可再产生完整的植株。
 形态建成：外植体在适宜的培养条件下经脱分化、
分化或直接发育成各种形态完整的植物体的过程。
 在愈伤组织培养物中，细胞分裂常以无规则方式
发生，并产生无明显形态或极性的无序结构组织
块，这时虽然在愈伤组织中发生了细胞分化，形
成维管化组织和瘤状结构，但并无器官发生。只
有满足某些条件，才可从愈伤组织发生再分化而
产生苗或根的分生组织，甚至胚状体，进而使它
发育成苗或完整植株。

在组织培养中，从外植体形成器官或无
性系的形态发生，有下面两种方式：
 1．不定芽方式（unfixed bud） 指细
胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽
再生成植株，这是细胞和组织培养中常
见的器官发生方式。愈伤组织的器官发
生顺序有四种情况：
 （1）愈伤组织中有根或芽器官的分别形
成，即无根的芽或无芽的根；
 （2）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎
的基部长出根而形成小植株，多数植物
属这种情况；

（3）先产生根，再从根的基部分化出芽
而形成小植株。这种情况较难诱导芽的
形成，尤其对于单子叶植物；
 （4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别
形成芽和根，然后两者结合起来形成一
株小植株。
 2．胚状体方式（somatic embryo） 指
由培养细胞诱导分化出的胚芽、胚根、
胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。
（以后章节中介绍）

六．愈伤组织形态发生的调控
来源于不同植物或同一种植物不同部们
的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性
上都可能存在差异，其遗传生理功能也
可能或是具有胚性，或是不具胚性，在
不同的实验中由于目的的不同，对愈伤
组织状态的要求也不完全相同，但优良
的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中
的2-3个。
 1.高度的胚性或再分化能力，以便从这
些愈伤组织得到再生植物。

2．容易散碎，以便用这些愈伤组织建立
优良的悬浮系，并且在需要时能从中分
离出全能性的原生质体。
 3. 旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈
伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。
 4．经过长期继代保存而不丧失胚性，有
便有可能对它们进行各种遗传操作。
 细胞和愈伤组织的形态发生，主要受外
植体本身、培养基和培养环境等三大类
因素的调控。

（一）材料本身
 1．遗传型 材料的基因型对愈伤组织的
器官分化有决定性的影响。不同植物种的
器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜和矮
牵牛等植物容易诱导器官形成，而禾谷类、
豆类、棉花等就比较困难。
 2．器官和部位 通常同一种植物的不同器
官或组织所形成的愈伤组织，无论在生理
上或形态上，其差别均不大。但是有些植
物而言，确有明显差异。如油菜的花器官
比叶、根易于分化成苗，水稻和小麦幼穗
的苗分化频率也比其他器官为高。
 3．年龄 年龄较幼的外植体，不仅易于
诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分
化成植株。如油菜植株的自下而上的茎
段的培养结果表明，下部的器官形成频
率低，愈入上部，苗的分化频率越高，
苗分化频率越低。因此在组织培养中，
要及时转移已形成的愈伤组织进行分化
培养，可大大提高苗的分化频率。
（二）培养基
 培养基的各种成分和物理性质，都对器
官发生产生一定影响，但起决定作用的
仍然是植物生长调节剂，特别是生长素
和细胞分裂素的配比。
 1．生长调节剂 细胞分裂素/生长素的
比例是控制芽和根形成的重要条件之一，
生长素对芽的抑制作用可为细胞分裂素
所克服。细胞分裂素/生长素比例高时有
利于芽形成；而这一比例低时，有利于
根的形成。这样通过变换激素的种类和
浓度，即可有效地调节培养组织的器官
分化。


但是，要注意的是不同的生长素和细胞
分裂素，对生根和长芽的效果是不同的。
如NAA对生根的作用比IAA和IBA的效果好，
但用IAA和IBA处理，产生的根比较健壮，
而用NAA处理，产生的根则较纤细。2，
4-D往往对生根不利，特别是在较高浓度
下。Kt和BA能广泛地诱导芽的形成，但
BA比Kt的效力大。玉米素的作用范围较
窄，但对某些植物有特效。因此，往往
多数植物采用BA 和Kt来诱导芽的形成。
2．无机营养元素
 在植物组织培养中和整体植物一样，细
胞的生长也要求满足植物生长的必要元
素，若完全投入或过多或不足，也会影
响细胞生长和分化。不过其影响不如激
素的影响明显。但是各种类型的植物，
器官所需要的每种元素的量，特别是大
量元素是有区别的，如生根培养要求无
机离子浓度小一些，所以常用1/2MS或
White。如有些植物要求的氮，以硝酸态
形式供应为佳；而有些植物要求的氮，
以铵态氮的形式供应为佳。

当某些营养元素的供应不足时，愈伤组
织所表现出来的症状如下：
 氮——某些组织（如五叶地锦）表现出
一种很引入注目的花色素苷的颜色；不
能形成导管。
 氮、钾和磷——细胞过度生长，形成层
组织减退；
 硫——非常明显地褪绿。
 铁——细胞分裂停止。
 硼——细胞分裂停滞，细胞伸长。
 锰或钼——影响细胞伸长。


3．有机成分
 在培养基中加了糖各类B族维生素、肌
醇和甘氯酸等，可以满足愈伤组织的生
长和分化的要求。各中氯基酸和嘌 呤、
嘧啶类物质，可以促进器官分化。其中
酪氨酸可明显增加烟草组织培养的器官
形成。酰胺类往往有促进器官形成的作
用。水解酪蛋白中含有多种氨基酸，在
进行器官分化培养时，加入一定量是有
益的。
4． 物理性质
 培养基的物理性质（固体或液体状态，
渗透压等）对形态发生有明显的影响。
在胡萝卜和石刁柏的培养过程中，需要
改变培养基的形式，才能顺利地分化出
苗。其方法是：第一阶段诱导形成愈伤
组织，应在固体培养基上进行培养；第
二阶段细胞和胚状体的增殖，需在液体
培养基中完成；第三阶段由胚状体发育
成可移植的植株，又应转移到固体琼脂
培养基上进行培养。


培养基中的渗透压，对细胞增殖和胚状
体的形成都有十分明显的影响，在花药
培养中受到普遍的重视。如油菜花药培
养宜先在高糖（9-10%）培养基中培养，
有利于细胞增殖和胚状体的形成。
（三）培养环境条件
 光周期的影响： 光周期的需要与否，应根据植
物种类培养目的来决定。
 在愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全
暗、周期性光照、散射性光照，上述两种做法
诱导率差异不大。另一些植物差异较大，如石
刁柏全暗诱导愈伤组织，要比周期性光照下好
得多。大豆愈伤组织诱导采用散射性光照比较
好；光照对地钱干重的增加明显地优于黑暗培
养。
 器官发生阶段，一般给予周期性光照比较好。
光周期长短因植物种类而异。多数植物8-10小
时黑暗为宜。如茄子、苹果等。也有例外，有
些植物如石刁柏需要16小时光照，12小时黑暗。


温度：在组织培养中，一般都采用22-25℃的
恒温条件下进行外植体的培养。对一般植物来
讲，都可较好地形成芽和根。但是很多资料表
明 ，温度高低对器官发生的数量和质量仍有
影响。如对喜温性植物如茄科、葫芦科、兰科、
禾本科等的培养温度一般可控制在26-28℃比
较适宜。而对于冷凉性植物如百合科、十字花
科、菊科等植物则培养温度可控制在25℃以下
较为适宜。
培养周期中的昼夜温差，至今，多数植物离
体培养，均采用恒温培养。而国内有关小麦、
水稻花药培养温度试验的报道认为：在诱导花
形成愈伤组织时，昼夜恒温较好，而在器官分
化时，昼夜具有一定温差比较好，分化出的小
植株比较健壮。菊芋试验也有类似的报道。
第五章 器官发生与体细胞
胚胎发生
 一．器官发生
（一）概念：离体培养的组织、细胞在诱导条
件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的
过程。
 （二）发生方式：有两种发生方式
 （1）直接发生：（具有初生分生能力的）外
植体直接分化成器官的过程。（由茎尖、腋芽、
原球茎、块茎、鳞茎等器官发生）
 （2）间接发生：外植体（已分化的成熟组织）
经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。

二.胚状体发生(somatic embryo)
指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、
胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。
 由外植体经胚状体形成完整植株可分三
个不同发育阶段：
 1)外植体细胞脱分化。外植体发生细胞
分裂，或进而形成愈伤组织。这一阶段
同不定芽方式一样。
 2)胚状体形成 在植物有性生殖中，精
于和卵子结合形成合子，合子进一步发
育成胚。
但在组织培养条件下胚状体的发育过程
是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分
裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、
心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而
成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织
的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直
接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。
 3)胚状体再发育成完整植株 在外观上，
这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起
的形状。

 三.
胚状体与不定芽的区别
胚状体在组织学上具备以下和不定芽不
同的三个特征：
 ①最根本的特征是具有两极性，即在发
育的早期阶段，从其方向相反的两端分
化出茎端和根端，而不定芽或不定根都
为单向极性。
 ②胚状体的维管组织与外植体的维管组
织无解剖结构上的联系，而不定芽或不
定根往往总是与愈伤组织的维管组织相
联系。

③胚状体的维管组织的分布是独立的“v”
字形，而不定芽的维管组织无此现象。
 胚状体也是植物组织培养形态发生最常
见而重要的方式，它较不定芽方式有更
多的优点：如胚状体产生伪数量比不定
芽多；胚状体可制成人工种子，便于运
输和保存；胚状体的有性后代遗传性更
接近母体植株。这些对组织培养应用于
育种是十分有利而重要的。

四. 胚状体与合子胚的比较
合子胚
胚状体
质量
萌发率高，质量 萌发率低，质量
好
差
来源
受精卵
体细胞
胚柄
有，明显
即使有也不明显
形态
固定，体积相对 复杂，常有两个
较小
以上的子叶体积
相对较大
变异率
低
高
 五.影响体细胞胚胎发生的因素

1．生长调节物质
 (1)生长素类：
 我们以离体培养条件下胡萝卜的体细胞胚胎发
生的诱导过程来进行分析，在离体条件下胡萝
卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，
每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤组织的
建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养
（增殖培养基），通常所用的生长素是2，4-D，
浓度范围0.5—1mg/L。在这样一种培养上，愈

伤组织的若干部位分化形成分生细胞团，称作
“胚性细胞团”。在增殖培养基上反复继代，胚
性细胞团的数量不断增加，但并不出现成熟的胚。
然而，如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量
很低或完全没有生长素的培养（成胚培养基）上，
它们就能发育为成熟的胚。看来，在增殖培养基
中生长素的存在，对于胚性细胞团后来在成胚培
养基上发育为胚是必不可少的。一直保存在无生
长素培养基中的愈伤组织不能形成胚。在这个意
义上，可把增殖培养基看成是体细胞胚胎发生的
诱导培养基，而把每个胚性细胞团看成是一个无
结构的胚。
（2）细胞分裂素类：
 细胞分裂素对于体细胞胚胎发生的作用有相反
的结论，既或促进也可抑制体细胞胚的发生，
这主要取决于植物的种类及其基因型。一般而
言，细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显
著作用，特别有利于子叶的发育。另外有研究
表明，不同的外植体对于细胞分裂素的需要可
能具有不同的专一性，如在胡萝卜的研究中发
现，虽然BAP和激动素对胚胎发生过程表现抑
制作用，但浓度为0.1μmol/L的玉米素却能促进
这个过程，而BA对胡萝卜则是促进其愈伤组
织的增殖，但不形成胚性愈伤组织。

（3）赤霉素类：
 赤霉素类能抑制体细胞胚胎发生，但对于许多
植物而言，赤霉素对于体细胞胚胎的成熟与萌
发有促进作用。
 （4）脱落酸：
 抑制剂特别是ABA，在体细胞胚胎发生过程中
的作用正逐渐被提示出来，ABA是一种天然产
生的生长调节剂，当把无抑制作用剂量（通常
是0.1~1μM）的ABA用于荷兰芹属培养物时，
可以允许胚成熟过程进行。但是其抑制异常增
殖，包括不定胚的启动。另一方面抑制早熟萌
发。


2．氮源
 氮源的形态有还原态氮（NH4+）和氧化
态氮（NO3—）两种。在以KNO3为唯一
氮源（如White培养基）的培养上建立起
来的愈伤组织，去掉生长素以后不能形
成胚。然而是，若在培养基中加入少量
NH4Cl即可明显促进胚状体的发育，上述
结论是否说明，胚胎发生过程中还原态
氮是必需的？我们可以对以下的实验进
行分析。
Reinert及基合作者在栽培胡萝卜愈伤组织培养中
( 培养基均为White培养基)得到以下结果：
[NH4+—氮]（M）
（个/2ml）
[NO3——氮] （M）
体胚发生数
10
40
1131±219
0
55
19±0.3
0
95
11.3±4.1
 从上表可以分析得出，尽管高浓度的氧化态
氮同样可以诱导体细胞胚胎发生，但是其诱导
率远远低于还原态氮和氧化态氮配合使用时的
诱导率。
 六.

长期培养物形态发生潜力的丧失
有些愈伤组织或悬浮培养物起初具有器
官发生或胚胎发生的潜力，但经过反复
继代保存之后喧种形态发生能力常常逐
渐下降，有些甚至完全损失。为了解释
这种现象，现在有三种假说。

1．遗传说
 该假说认为，形态发生潜力的丧失是由
于在培养细胞中的核的特性发生了改变，
即细胞核内的遗传物质在培养继代过程
中由于变异等原因而发生了改变或是突
变。因此，可以推知，由这种原因所造
成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。

2．生理说
 从前面体细胞胚胎发生中的甜橙的驯化
组织的形成的实例中，不难分析，随着
不断的培养继代的进行，培养组织或细
胞中的内源激素平衡关系可能会发生改
变，而导致不能形态发生。在这种情况
下，细胞虽然停止了器官和胚胎的分化，
但并不一定就丧失了这种分化能力。因
而，在这种情况下，如果改变外部处理
条件，应该有可能使细胞的这种内在潜
力得到恢复。

3．竞争说
这个假说本质上是前两个假说的结合。按照这
个假说的倡议者Smith 和Street（1974）的看
法，在胡萝卜细胞长其连续继代培养基间，有
两个过程可能与胚胎发生能力的下降以至最终
的丧失有关。首先，细胞对于生长素（2，4-D）
抑制全能性表达的作用变得比较敏感；其次，
随着时间的推移，由于培养细胞在细胞学上的
不稳定性，出现了缺乏胚性潜力的新的细胞系，
这些细胞学上的变化不一定是染色体数目的变
化，而可能只是遗传信息的小的突变、丢失或
易位，实际上，Jones（1974）已经证实，在
胡萝卜培养物中，细胞群体在成胚能力上的不
稳定性，可能是由用于建立该培养物的组织带
来的。
在复杂的多细胞外植体中，只有少数细胞能够
产生胚性细胞团，其余细胞都是无法表达其全
能性的。按照这种假说，如果非胚性的细胞类
型在所用的培养基中具有生长上的选择优势，
在反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会
爱步增加，而胚性成分则逐渐减少。到了一定
时期之后，在培养物中已不再含有任何胚性细
胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不
可能了。然而，如果在培养物中存在少量胚性
细胞，只是由于处在支配地位的非胚性细胞的
抑制作用，这些胚性细胞的全能性无法表达，
在这种情况下，通过改变培养基成分，使之有
选择地促进全能细胞的增殖，就应当有可能恢
复该培养物的形态发生潜力。
第六章 快速繁殖与脱毒培养
 第一节
快速繁殖（微繁殖）
概念：所谓快速繁殖，就是得用组织培养的
方法，使植物的部分器官、组织在人工控制
的适宜条件下，迅速扩大培养，并移植到温
室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。
 特点：繁殖速度快；使用材料少，生产效率
高，省时省工；节约空间有利于植物的工厂
化生产；在无菌条件下进行，不受病虫害侵
害。

主要适用于（1）加速某些难繁或繁殖速
度低的植物，特别是一些珍稀名贵的花
卉，需要发展的濒危植物的繁殖。（2）
用有性繁殖的方法难以保持品种特性的
异花授粉植物，如油棕、猕猴桃、非洲
菊等。（3）需要去除病毒的植物。（4）
原种很少，生产上又急需推广的植物
 快速繁殖过程
 快速繁殖过程一般包括四个阶段，即无
菌培养物的建立、芽的增殖、诱导生根
和试管苗的移植。


一．外植体的选择 选择适当的外植体对
于快速繁殖能否成功是极其重要的，而选
择什么样的外植体首先决定于第二阶段芽
的增殖所采用的途径。
通过腋芽的形成来增加芽的数量时，应从带有
营养芽的部分得到外植体，并注意以下问
 （1）外植体大小，如为一般繁殖而非脱毒繁殖，
可使用普通茎尖、芽或带芽的茎切段作为外植体。
 （2）取材植株的生理状态对培养成败是极重要
的，一般在植物开始生长，芽已膨大但芽鳞片还
未张开时最为合适，此时芽生长旺盛，并有芽鳞
片的保护，不易污染。

为了避免季节的影响，在有条件时也可以将植
物放在光、温条件稳定的人工气候箱或温室中，
使植物保持营养生长状态，对某些需低温或高
温或特殊光周期处理才能打破休眠的块茎、鳞
茎、球茎等，常要处理后才可剥取茎尖进行培
养。
 （3）芽在植物株上的部位也是需要注意的，
在一些草本植物（如菊花等）中，使用顶芽或
上部的芽作为分生组织或茎尖培养时的成功率
常比侧芽或基部的芽要高，这可能和它们生长
较旺盛有产。


（4）多年生的木本植物随着年龄的增加，分
生组织、茎尖和芽的培养越困难，特别是成年
树较幼态树的培养要困难得多，此时，常使用
部分返幼阶段或年龄较低的根蘖苗或不定芽做
材料，或采取某些措施如将芽接在实生苗上，
修剪、保持高水平的水肥进行营养繁殖，或用
细胞分裂素喷洒植株的方法等。
在通过不定芽途径使芽增殖时，可以根
据不同的植物采用不同的外植体，如根、
茎、叶或花器官的各部分，在自然界中
能够产生不定芽的器官应当首先被采用，
如非洲紫罗兰、秋海棠、大岩桐、落地
生根等可用叶片，某些兰花等可以用茎
尖；很多种植物，特别是单子叶植物，
可以作用花器官，如黄花菜、鸢尾等。
 在使用体细胞胚胎发生途径时，常使用
胚分生组织或生殖器官作为外植体

二 . 芽的诱导及扩大化繁殖（增殖）
 这是快繁技术中最重要性一环，在这一
阶段潜在的植物体体（芽或胚状体）通
过腋芽的形成和生长、外植体或愈伤组
织上不定芽的形成和胚状体发生三条件
途径在数量上得迅速增殖，由于外植体
种类的不同，在增殖时可能采用的途径
不同。

（1）. 促进腋芽的形成和生长
 在高等植物的每一个叶腋中通常都存在着腋芽，
每一个腋芽在一定的条件下都能生长并形成一
个枝条，项端优势可抑制腋芽生长，使用外源
的细胞分裂素可以打破顶端优势，促进腋芽生
长。在培养条件下，为了促使腋芽生长，需在
培养基中加入一定浓度的合适种类的细胞分裂
素，有时同时可加入少量的生长素以促进腋芽
的生长（注意：生长素过多易导致愈伤化）。
由于细胞分裂素的持续作用，腋芽生长成枝条，
新产生的枝条的腋芽在细胞分裂素的作用下又
可生长，这样反复数次就可以形成一丛嫩枝，
将它们切割成带有几个芽的小块接种到同样的
培养基上，这一过程又能重复进行，这样就可
以在短时间内产生大量的芽。

有些植物即使在含有细胞分裂素的培养基中其
项端优势也不易被打破，接种的茎尖只能长成
不分枝的一根枝条，此时可以用切段法（每个
切段带有一个腋芽）加以繁殖。
 用促进腋芽生长的方式进行增殖时，一般速度
较其它两种方法要慢些，但每经一个流程，嫩
枝就以对数速度增长，并且由于茎尖的细胞是
均一的二倍体，又不易受环境条件的影响而发
生变异，所以遗传的稳定性较好，适用这种方
法繁殖的植物种类也较多。




（2）. 诱导不定芽的形成 从现存的芽之外的任何组织
器官上通过器官发生行政机关后期怕芽称为不定芽。
通过不定芽形成途径进行快繁，对于很多有贮藏器官的植
物如百合、风信子等是很合适的，因为这些植物在自然条
件下的营养繁殖速度一般不太快，而它的鳞片、叶基部或
花梗等在培养时都容易产生不定芽或小鳞茎或小球茎等不
定器官，而且这一过程常可在试管中反复进行。
不定芽也可以在愈伤组织上上产生，但如果经过愈伤组织
阶段，特别是多次继代的愈伤组织，不但器官发生的能力
会逐渐降低以至完全丧失，而且后代的遗传性不能稳定，
所以在快速繁殖中除少数作物外常不使用这种方法。对于
不定芽的形成，除特殊情况外，一般都要在培养基中同时
加入适当的细胞分裂素和生长素。

（3）．诱导胚状体的形成

在自然界只有少数植物可以通过体细胞
胚胎发生而产生胚状体，但在培养条件
下，现在已知有30多个科、150多种植物
可以产生胚状体。诱导胚状体时一般使
用胚分生组织或生殖器官的组织作为外
植体。在一个含有丰富还原态氮的基本
培养基，在存在生长素，特别是2，4-D
时诱导胚状体的发生，然后转移到降低
浓度呀没有生长素的培养基上使胚状体
成熟和生长。

通过胚状体发生途径可以在一个委小的
容器中产生比前两种增殖方法高得多的
增殖速度，而且由于胚状体是两极性的
可以免去诱导生根的步骤，加上它容易
分散，可以减少前两种增殖方法中因分
离、切割、接种所需消耗的大量人力，
有利于将来实行机械化的操作。如果能
够控制好胚状体发生和生长的同步性，
诱导休眠和制造人工种子的技术无疑将
是最理想的快速繁方法，但是目前除柑
桔、枣椰、油棕和咖啡等少数作物外，
种方法使用并不普遍。这是因为很多重
要的经济作物还不能诱导胚状体的发生
或者产生的胚状体难以形成植株，或成
苗率太低。另外遗传性的变异和由胚状
体形成的植株的返幼（多年生植物的胚
状体长成的植株和实生苗一样要经过一
个幼年期才能开花结果）也是重要的障
碍。
三. 根的诱导
 这一阶段的目的是使第二阶段通过腋芽
生长和不定芽形成途径得到的嫩枝生根
产生小植株，以便移栽。很多草本植物
的不定根的形成是很容易的，但木本植
物一般要困难些，其中从成年树得到的
材料就更困难。由于生长的嫩枝本身能
全盛丰富的生长素，所以一部分植物可
在无激素的培养基上生根。


（1）．剪下无根苗转接到生根培养基中，
试管苗的生根，对基本培养基的种类要求
不严，如MS、B5、White等培养基，都可用
于诱导生根，但是其含盐浓度要适当加以
稀释。前面的几种培养基中，除White外，
都富含N，P，K盐，它们都抑制根的发生。
因此，应将它们降低到1／2，1／3或1／4，
甚至更低的水平。生根培养基适当加大生
长素的浓度，不用或少用细胞分裂素，生
长素浓度在0.1-10mg/l，使用较多的是NAA，
其次为IAA和IBA，生长素浓度过高时容易

引起愈伤组织化和抑制根的生长。培养
基中蔗糖的浓度降低到1.0-1.5%，以增
强植株的自养能力。培养基不宜过硬以
免影响生根，可在培养基中加入1%左右
的活性碳，为提高小植株的光合能力，
可将光强度增加到3000-10000lux，光周
期可用24小时光照或16小时，8小时黑暗
以利于光形成建成。
（2）．对较难诱导生根的植物，可先半无根苗
浸泡在高浓度生长素（100mg/L）的无菌水中几
小时到1天，用无菌水洗净生长素后再接种到生
根培养基。对蔷薇科的果树如苹果、梨等，可
在生 根 培养 基 中加 入 适量 的 根皮 苷 或根 皮酚
（ 间 苯 三 酚 ） 以 促 进 根 的 形 成 ， 浓 度 约 150
mg/L，但也发现对一种李树而PG加入后反而抑
制根的形成，说明PG的刺激效应可能因基因型
而不同。
 （3）．嫁接到根系发达、抗逆性强的合适砧木
上，如三倍体西瓜苗接到瓠子上，在25-30℃、
饱和湿度条件下，三天伤口长出愈伤，一周可
成活。

 第二节 . 植物无病毒苗的培育
 一、病毒在植物上的危害
病毒的危害给植物生产带来的损失是很大
的，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重
降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡
萄减产l0%-18%，为害马铃薯的病虫害则更
多，大约有几十种，田此，给马铃薯生产
带来严重障碍。花卉病毒的危害一般会影
响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，
产生畸形、变色等。
由于病毒对植物造成如此严重的危害。
所以世界各国都开始重视这方面的研究，
如日本用柑桔茎尖微嫁接繁殖无病毒柑
桔营养系。美国用组织培养法，使苹果
无病毒苗已工厂化育苗，并在各国普遍
开展。
 二、无病毒苗培育的意义
用组织培养方法生产无毒苗，是一个积
极有效的途径，由于排除了使用药剂，
所以对减少污染，防止公害，保护环境
都有积极的意义。
三、脱毒的方法
 （一） 热处理脱毒
 1．热处理法的发现及应用
热处理又称温治疗法(theomtherapy)，
原理是当植物组织处于高于正常温度的
环境中时，组织内部的病毒受热之后部
分或全部钝化，在高温下，不能生成或
生成病毒很少，而破坏却日趋严重，以
致病毒含量不断降低，这样持续一段时
间，病毒自行消灭，从而达到脱毒的目
的。

(1)温汤浸渍处理 适用于休眠器官、剪下的接
穗或种植的材料，在50℃左右的温水中浸渍
10min至数小时，方法简便易行，但易使材料
受伤。
 (2)热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖
效果较好，将生长的盆栽植株移入温热治疗室
(箱)内，一般在35—40℃。处理时间因植物而
异，短则几十分钟，长可达数月。
 热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒，
因此热处理需与其他方法配合应用，才可获得
良好的效果。

（二）茎尖培养脱毒
 1．茎尖培养脱毒原理

感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，
病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎
顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点(约
0.1～1.0mm区域)则几乎不含或含病毒很少、
这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过
胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的
生长速度。在切取茎尖时越小越好，但太小则
不易成活，过大又不能保证完全除去病毒。
茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代
稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重
要的一个途径。

茎尖培养方法
在进行脱毒培养时，由于微小的茎尖
组织很难靠肉眼操作，因而需用带有适
当光源的简单解剖镜(8—40倍)。除了在
进行植物组织无菌培养一般工具外，还
需要一套解剖刀。剥离茎尖时，应尽快
接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，
以防茎尖变干。在切取外植体之前一般
须对茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧
的芽，如菊花、兰花，只须在75%酒精中
浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，则要
用0.1%次氯酸钠表面消毒10min。将接处
好的茎尖置于22℃左右的温度下。每天
以16h 2000—30001x的光照条件下培养。
由于在低温和短日照下，茎尖有可能进
入休眠；所以较高的温度和充足的日照
时间必须保证。微茎尖需数月培养才能
成功。
 茎尖培养的继代培养和生根培养和一般
器官的培养相同

（三） 其他途径脱毒
1.愈伤组织培养脱毒
通过植物的器官和组织的培养去分分诱导产生
愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长
成小植株，可以得到无病毒苗。
 2．茎尖微体嫁接
木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗
砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病
树枝上切取0.4—1.0mm茎尖，在砧木上进行试
管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。

许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、
氨基酸、抗菌素等)对离体组织和原生质
体具有脱毒效果。常用的药品有：8—氮
鸟嘌呤、2—硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、
放线菌素D、庆大霉素等。例如，将
100μg 2—硫脲嘧啶加入培养基可除去烟
草愈伤组织中的PVY(马铃薯病毒)。

四.病毒植物的鉴定
（一）指示植物(indmatingplant)法

利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴
别病毒种类的方法，就是枯斑和空斑的测定法。
这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示
植物，又称鉴别寄主。它只能鉴定靠汁液传染
的病毒。

指示植物法最早是美国的病毒学家Holmes
1929年发现的。他用感染TMV的昔通烟叶的粗
汁液和少许金刚砂相混合，然后在烟叶子上摩
擦2—3d后叶片止出现了局部坏死斑。在一定
范围内，枯斑与侵染性病毒的浓度成正比。这

种方法条件简单，操作方便，故一直沿用至今，
仍为一种经济而有效的鉴定方法。枯斑法不能
测出病毒总的核蛋白浓度，而只能测出病毒的
相对感染力。
 由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的
病毒选择适合的指示植物。此外还要求所选择
的指示植物不但一年四季都容易栽培，并且在
较长的时期内还能保持对病毒的敏感性和容易
接种，而且在较广的范围内具有同样的反应。
指示植物一般有两种类型：一种是接种后产生
系统性症状，其病毒可扩展到植物非接种部位，
通常没有局部病斑；另一种是只产生局部病斑，

常由坏死、褪绿或环状病斑构成。
 木本多年生果树植物及草莓等无性繁殖的草本
植物用汁液接种法比较困难，所以通常采用嫁
接接种的方法。植物作砧木，被鉴定植物作接
穗，常用劈接法。
 （二）抗血清(antisemm)鉴定法
用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。这种
抗血清就是高度专一性的试剂，这种方法特异
性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就
可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中
最有用的方法之一。

（三）电子显微镜(elecmc microscope)检查法
由于人的眼睛难以观察小于0.1mm的微粒，
而借助于普通光学显微镜也只能看到小至
200bm的微粒，所以只有通过电子显微镜才能
分辨0.5μm大小的病毒颗粒。这样采用电子显
微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存
在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可
以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，
但需一定的设备和技术。
这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗
提取液中定量测定病毒。

（四）酶联免疫鉴定法(Enzyme linked
immunity absorption assay ELISA)
酶联免疫法是指采用酶标记抗原或抗
体的定量测定法。将抗原固定在支持物
上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化
物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检
血清中与对应抗原的特异性抗体结合，
最后用特殊分光光度计测定。此法是现
在灵敏度较高和常使用的方法。

五． 无病毒植物的利用
一、无病毒苗的保存繁殖
无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有
可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无
病毒苗，就应很好地隔离与保存。
 二、无病毒苗的利用
无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再
感染。生产场所应隔离病毒感染途径，做好土
壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模
小的地方，要较长时间才会感染。而在种植时
间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就
可以感染。一旦感染，便会影响产量和质量的
保证。因此，应重新采用无病毒苗，以保证生
产的质量。


三、无病毒苗的效果
无病毒苗可以表现出明显的优良效果。如
草莓可增产20%—50%，植株结果多，单果重
增加，上等果比例提高。菊花切花品种的脱毒
株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，
切花较重等特点。