Transcript kromoszóma szintű hibák kimutatása

KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK
KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK
Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna
Országos Kémiai Biztonsági Intézet
Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály
Budapest, Nagyvárad tér 2.
Helyszín: ELTE, 2012. 10. 27.
Kompartmentalizáció
Prokarióta sejtek
Eukarióta sejtek
Kromatinalapszerkezet:
nukleoszóma
* DNS kettős spirál és a hisztonok alkotják
* Hisztonok: bázikus fehérjék
(argininben és lizinben gazdag)
* 5 osztályuk van: H1H1, H2A, H2B, H3 és
H4
nukleoszomális hisztonok
Hisztonkorong (oktamer):
8 hisztonmolekulából álló (2*4)
2 csavarulatban
146 bázispárnyi DNS tekeredik rá
2 korong között kb. 60 bp linkerrégió + H1
molekula
A DNS kondenzációját
a kondenzin foszforilációja
indítja el.
kohezin ATP-áz
Kromoszóma morfológia
Eukromatikus régió:
aktív géneket tartalmaz
(génexpresszió, RNS szintézis)
Heterokromatikus régió:
inaktív DNS szakaszok
rövid kar
konstitutív heterokromatin (pl. centromer)
fakultatív heteroktromatikus régió
centroméra
hosszú kar
testvérkromatidák
Kromoszóma territórium
Egy adott kromoszóma a sejtmag
egy adott régiójában található.
Szigorú sejtmagi rend.
Fajok
Kromoszómaszám
ecetmuslica
rozs
galamb
egér
patkány
ember
mezei nyúl
kutya
ponty
páfrány
8
14
16
40
42
46
48
78
104
1200
Humán lymphocyta kromoszóma preparátum
Genom: a sejtmagban található összes genetikai információ.
Kromoszóma: A genetikai információt tároló strukturális egység.
Kromoszóma száma, morfológiája szervezettsége fajra jellemző és állandó.
Humán kromoszóma
Gének
1
2 968
13
748
18
766
21
303
X
1184 (Barr test)
Y
231 (mikrodeléció meddőség)
Nemhez kötött öröklődés
G-sávos normál női karyotípus
Öregedés, rák, stabil kromoszóma
Telomer:
- kromoszóma vége
- rövid TTAGGG szakasz több ezerszeres mennyiségben (20-25 ezer bázispár)
genetikai óra, telomer rövidülés öregedés
2009 orvosi Nobel Díj
- minden osztódáskor 100 bp rövidülés a DNS polimeráz enzim
működéséből adódóan
- egészséges sejtekben a telomeraz inaktív
- Az emberi sejt 50 osztódásra képes.
- 50 osztódás után a sejt apoptózissal meghal.
Tumoros sejtekben a telomer szerepe:
-a telomeráz enzim aktivitása magasabb
-Azt gondolják, hogy a telomeráz enzim retrovírus eredetű.
-Ivarsejtekben is!
MITOZIS
*
*
*
A mitózis gondoskodik a szülői és az utódsejt azonos kromoszómakészletéről. A
sejtosztódás S fázisában a kromoszómák anyaga megkettőződik. A mitózis kromoszóma
számtartó osztódás.
A mitózis és meiózis összehasonlító elemzése
X-kromoszóma inaktiváció
A nőstény emlősök sejtjeiben
Az egyik X-kromoszóma inaktiválódik (random módon), XfXv .
Az inaktivált X kondenzálódik - Barr-testecske.
Bizonyos sejtek utódai együtt maradnak (sejtklónok).
A nőstény emlősök teste mozaikos, vagyis olyan sejtek
klónjainak a keveréke, amelyekben hol egyik, hol a másik X aktív.
Heterozigótákon
detektálhatók lehetnek a foltok.
Vörös/fekete tarka macskák esete
Hemofilia
A
VIII. faktor
Xq28
Nemhez kötött recesszív megbetegedés
B
IX. faktor
Xq26.3Xq26.3-27.1
KROMOSZÓMA ABERRÁCIÓ TÍPUSAI:
Strukturális kromoszóma aberráció:
deléció
inszerció
transzlokáció
Numerikus kromoszóma aberráció:
poliploidia
aneuploidia
Deléció
kromoszóma szegmentek elvesztése
Különböző humán betegségek delécióra vezethetőek vissza.
A kis deléciók tolerálhatóak.
A nagy deléciók nem tolerálhatóak, letalitáshoz vezetnek.
Cri du chat – macskasírás szindróma
•
•
•
•
Az ember esetében a genom kiegyensúlyozatlanság miatt a legkisebb
deléciók is komoly abnormalitást okoznak.
A macskasírás szindróma estében az 5. kromoszóma rövid (p)
karjának vége hiányzik.
Mikroencefáliával, holdszerű arccal és szellemi elmaradottsággal jár.
4 év alatti halál.
születéskori gyakoriság:
1/50,000
Rákos sejtek gyakran mutatnak deléciókat
DUPLIKÁCIÓ:
Kromoszóma szegmensek megkettőződése.
Jó példa a duplikációra a Drosophila Bar mutációja.
Az X kromoszóma 16A régiójának kópia száma
különböző
A gén duplikáció evolúciós szerepe
Ha a gén fontos a szervezet számára nem változhat.
De ha a génből több kópia van a képződő proteinek
módosulhatnak és új funkciókat láthatnak el.
Duplikációval keletkezett gén családok
hasonló proteineket készítenek.
Jó példa erre a globin gének,
amelyekről α és β globin láncok szintetizálódnak,
a hemoglobin szerkezeti alegységei.
A gén duplikáció lehetőséget ad, a mutációs
változásoknak, a funkciók divergálásának
•
Az emberi hemoglobin gén duplikációs változások eredménye.
Különböző életkorokban különböző alegységek alakítják ki a
működő hemoglobin molekulát.
3 hónapos korig az embrionális Hemg.
Szülésig a magzati Hemg. 20-30%
Szülés után 2α 2ß.
Inverzió:
Egy kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulásának
az eredménye.
pericentrikus inverzió magába foglalja centromert
paracentrikus inverzió a centromert nem érinti,
csak a kromoszóma egyik v. másik karját
Gén környezet, gén kapcsoltság, génátírás módosul.
TRANSZLOKÁCIÓ:
intrakromoszómális transzlokáció:
Egy kromoszóma szakasz áthelyeződése
ugyanabba a kromoszómába.
interkromoszómális transzlokáció:
Nem homológ kromoszómák
közötti transzlokáció.
Transzlokáció során nincs genetikai anyag vesztés.
A gének pozíciója azonban megváltozik.
Down szindróma:
•14 és 21-es kromoszóma közötti Robertson transzlokáció.
A 21-es krom. transzlokációja a 14-es krom.-ra eredményezi a
familiáris Down syndromát.Örökölhető.
•21-es kromoszóma triszómia (Osztódási hiba)
Az anya életkorának előrehaladtával (40-45 év felett) az
előfordulási gyakoriság exp. növekszik. Prenatális szűrés.
Születéskori gyakorisága nagy:
1/500-1/700
Myeloid leukémia
A 9-es és a 22-es kromoszómák közötti transzlokáció
eredménye a “Philadelphia kromoszóma”
Az esetek 90%-ban krónikus myeloid leukemiát okoz.
Burkitt’s lymphoma
Az esetek 90% esetén a 8-as és 14-es
kromoszómák közötti transzlokáció
következménye.
Transzlokáció következtében kialakuló pozíció effektus
hatására kialakuló onkogének, sejtosztódást, rák
keletkezését okozhatják.
Alternatív toxikológiai módszerek
in vitro vizsgálatok
Ajánlott teszt rendszerek:
Genotoxikus és daganatkeltő hatások vizsgálata
1. Egysejtűeken végzett tesztek
2.
3.
4.
5.
6.
Rovartesztek
in vitro sejtkultúrákon végzett tesztek
in vivo mutagenitási tesztek
long term karcinogenitási állatkísérletek
humán epidemiológiai vizsgálatok
előnyei:
1. in vitro körülmények között sejteken (élő állat alkalmazása nélkül )
2. rövid idejű
3. olcsóbb
4. reprodukálható
5. nem használ élő állatot
Az esetleges hatás megállapításához több, különböző módszerrel végzett vizsgálat
egybehangzó eredményére van szükség.
Bevezetés
A BIZOTTSÁG 440/2008/EK RENDELETE
a vegyi anyagok regisztrálásáról,értékeléséről,engedélyezéséről és
korlátozásáról (REACH) szóló
a 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet értelmében
alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról.
B.rész.:Módszerek a toxicitás és egyéb egészségügyi hatások
meghatározására
B.10. Mutagenitás-Kromoszóma-Rendellenesség in vitro vizsgálata emlősökön
OECD 473 TG
OECD 487 TG in vitro mikronukleusz vizsgálat emlős sejteken
B.13/14. Mutagenitás: Reverz mutagenitási vizsgálat baktériumokkal
OECD 471 TG
B.18. DNS károsodás és –reparáció-nem tervezett DNS-szintészis
(unscheduled DNA Synthesis, UDS) –emlős sejteken in vitro
OECD 476 TG
B.19. In vitro emlőssejt testvér-kromatid kicserélődés
(sister chromatid exchange , SCE) vizsgálat
OECD 479 TG
B. 20. Nemhez kötött recesszív letális vizsgálat Drosophila melanogasteren
OECD 477 TG
Azonos szakmai szabályok
GLP= Good Laboratory Practice
(Helyes Laboratóriumi Gyakorlat)
ISO= International Organization for Standardization
(Nemzetközi Szabványügyi Szervezet)
Vizsgálati irányelvek
OECD= Organisation for Economical Cooperation and Development
(Gazdasági es Fejlesztési Együttműködési Szervezet)
Kromoszóma aberráció in vitro vizsgálata emlős sejteken
OECD TG 473 vizsgálati irányelv szerint
Célja: azon kémiai anyagok meghatározása, amelyek kromoszóma károsodást
okoznak emlős sejtekben.
A kromoszóma aberráció vizsgálat ismertetése
Sejtek
Alkalmazható sejtvonalak jellemzői:
stabil permanens v. primer sejtkultúrák (pl. CHO, humán lymfocita)
jó növekedési képesség, rövid generációs idő,
kariotípus stabilitás, állandó krom. szám.
Kromoszómák alaki változatossága és stabilitása.
kínai hörcsög ovárium fibroblaszt sejt (CHO, Puck1957)
Tápfolyadékok, tenyésztési körülmények
Mesterséges tápfolyadékok elterjedése (Ham’s F12).
Sejtvonalak ellenőrzése:
Kariogram
Kromoszóma szám
Mikoplazma
Spontán kromoszóma aberráció gyakoriság
Történeti kontroll
 Vizsgálati anyag előkészítése:
kémiai összetétel, szennyeződés, stabilitás
oldószer kiválasztása
hígítási sor készítése
stabilitás vizsgálat
archiválás
 Elő-kísérlet:
citotoxicitási vizsgálat
MTT-assay (mitokondriális szukcinát-dehidrogenáz enzim)
mitotikus index meghatározása
MI: A metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya.
A sejtpopuláció proliferációjának a mértékét jellemzi.
 Koncentráció
Legkevesebb három elemezhető koncentráció.
Citotoxikus anyag esetén: va. az a koncentrációja amely a festék-redukciót
50%-kal csökkenti.
Nem citotoxikus anyag esetén: va. 5 mg/ml v. 0,01M
Direkt-és indirekt-mutagén anyagok
Metabolikus aktiválás:
•S9 alkalmazása
rágcsálók enziminducerrel (Arochlor 1254, v. fenobarbiturát és
β-naftoflavon) kezelt májából előállított poszmitokondriális
frakció (S9)
•kofaktorokkal kiegészítve
(ADPH, glukóz-6-foszfát).
•S9 végkoncentráció 5-10% közötti.
•citokróm P450 enzim aktiválása.
•Indirekt mutagének kimutatására alkalmas
Kontrollok:
Metabolikus aktiválás nélkül: MMS, EMS, Mitomycin-C
Metabolikus aktiválással: CP, Benz(a)pirén
Oldószer: tápfolyadék, DMSO
Archiválás
Kezelési idők:
4 óra +S9
4 óra -S9
ÉRTÉKELÉS
pozitív
ismétlés
Negatív
24 óra -S9
48 óra -S9
 Kolhicinezés:
Célja a metafázisos kromoszómák összegyűjtése
Őszi kikerics (Colchicum autumnale) hagymájából készült kivonat.
Köszvény gyógyítására alkalmazták. A kolhicin sejtosztódás gátló, a mitózis
metafázisában.
Normál esetben a sejtek 2-5%-a osztódik, néhány órás kolhicinezés összegyűjti a
sejteket a metafázisban, akár 40-50 százalékuk is blokkolt metafázisban található.
A kolhicin a magorsó mikrotubulusaihoz kötődik.
Kromoszóma preparátum
 Fénymikroszkópos
kromatid típusú aberrációk:
deléció
exchange
értékelés
kromoszóma típusú aberrációk:
deléció
exchange
CHO sejt, kezeletlen kontroll. Felvétel: OKBI. MSBO. 2010.
CHO sejt, Deléció. Felvétel OKBI. MSBO. 2000.
CHO sejt. Deléció. Felvétel: OKBI. MSBO 2000.
Humán limfocita. Kezeletlen kontroll. Felvétel: OKBI. MSBO. 2000.
A környezeti arzén-expozíció
egészségkárosító hatásai
Arzénmérgezés”
Növekvő dózis
Teratogenitás; neurotoxikus hatás
Citotoxikus hatás (immuntoxicitás?)
Hormon diszruptor hatás
Glukokortikoid receptor gátlás
Ösztrogén receptor gátlás
Daganatkeltő hatás
Géntoxicitás (oxidatív stressz)
Repair gátlás (ligáz gátlás)
Epigenetikus hatás (metiláció)
Kromoszóma aberráció vizsgálat in vitro emlős sejteken
OECD TG 473
Normál metafázis
Endomitózis
Kromoszóma aberráció
Fragmentált kromoszómák
CHO-K1 (ATCC-CCL-61; Chinese hamster)
Kínai hörcsög ovárium fibroblaszt
Felvételek készültek: OKBI 2011
Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály
B.19. IN VITRO EMLŐSSEJT TESTVÉR – KROMATID KICSERÉLŐDÉS
(SISTER CHROMATID EXCHANGE , SCE) VIZSGÁLAT
OECD TG 479
Testvérkromatida
kicserélődés=sister
chromatid exchange
A testi sejtek kromoszómáiban a testvér-kromatidák közötti kicserélődés,
reciprok DNS csere.
Láthatóvá tehető, ha két sejtcikluson át bróm-dezoxi-uridinnel (timidin-analóg) jelöljük.
Hoechst festés, majd UV kezelés, klasszikus Giemsa festés.
Az SCE nem kromoszómaaberráció (Ctr. SCE 5).
Az SCE már olyan kis vegyi mutagén-karcinogén expozíció kiváltja, amelyik még
nem okoz krom. aberrációt.
Alkalmazása primer prevencióban.
Az SCE indukcióban a repair folyamatok részvétele valószínű.
A DNS repair deficiens congenitális defektusok esetében fokozott SCE
indukáltság figyelhető meg az egészséges kontrollokhoz képest. pl.:
Bloom szindróma
Fanconi-anémia
Werner sindróma
xeroderma pigmentosum
ataxia telangiectasia
Dow kór
Ataxia telangiectasia (ATM)
Rendkívül sokféle, sok szervet
érintő tünet együttes
sugár érzékenység
és tumorok kialakulása
Bloom szindróma
Kromoszóma instabilitás jellemzi
• Örökletes betegség, családi halmozódás
15q26.1, a BLM gén mutációja.
• Fokozott sister chromatid exchange (SCE) és spontán kromoszóma
törékenység.
• DNS repair enzimek károsodása
• Jelentős mutagén túlérzékenység.
•
a magasabb daganatképződési kockázat
normál sejt
Bloom szindromás beteg sejt
In vitro mikronukleusz teszt
mikronukleusz
OECD TG 487
Kromoszóma aberráció kimutatására
alkalmas
Kb 80% egyezés a kromoszóma aberráció
teszttel, olcsóbb, gyorsabb
Mikronukleusz: a sejtmagnál kisebb
méretű, membránhatárolt DNS darabok,
amelyek a citoplazmában jelennek meg a
sejtosztódás zavara esetén
apoptózis
A nemhez kötött recesszív mutagenitási
vizsgálat
(Müller-5 teszt) elvi vázlata
OECD TG
B. 18. Nem-tervezett DNS-szintézis (UDS)
in vitro vizsgálata emlős májsejteken OECD
TG 482
patkány primer májsejt
Jelölések:
*
= sárga testszínű kerek, piros szemű hím
kék
= kezeletlen X kromoszóma
piros = kezelt X kromoszóma
nyíl
= Y kromoszóma
Kinoxalin származékok vizsgálata
Népegészségügy 90 (1) 45-52 (2012)
Molinát és Vernolát gyomírtók repair-szintézist
idukáló hatása primer patkánymájsejtben
Egészségtudomány: 36,187-192 (1992)
A vizsgálatokat az OKBI molekuláris és Sejtbiológiai Osztályán végezték.
2012
ELTE
11.27.