Transcript 猪精液冷冻保存技术
猪精液冷冻保存技术 吉林省农业科学院 李兆华 内 容 猪精液冷冻保存的意义 猪精液冷冻技术研究概况 猪精液冷冻技术操作流程 影响猪精液冷冻效果的因素 如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力 猪精液冷冻保存的意义 1、延长公猪使用年限； 2、获得更大的遗传进展； 2、取代活体公猪的引进； 3、生物安全的保证。 猪精液冷冻技术研究概况 从意大利人Spallanzani最早开始研究哺乳动物精液 冷冻开始至己有200多年的历史 。 猪的精液冷冻研究是从1949年英国人Polge等发现甘 油(丙三醇)对牛精子具有抗冻保护作用后开始的。1956 年，他首次报道了应这个原理进行猪精液的冷冻操作， 并进行人工授精。 1957年Hess等将猪冻精经子宫颈输入，并产下仔猪。 1975年，Pursel等发明了简便的猪精液冷冻和解冻 方法，从此打开猪冷冻精液的商品化之路。 （用颗粒状冷冻精液给23头青年母猪输精, 48h后剖检11头,有5头受孕; 25-30d后剖检另外12头,有10头怀孕） 猪精液冷冻技术研究概况 我国从70年代初期开始对猪精液冷冻技术进行探索。 1975年西安市草滩农场试配了8头母猪 。 1977年成立了全国猪冻精协作组。 1986年冷冻精液累计配种母猪6万余头， 近几年： 甘肃农业大学 张兆旺教授 南京农业大学 芮荣教授 西北农林科技大学 李青旺教授 四川农业大学 马恒东教授 东北农业大学 刘娣教授 上海农科院 张德福研究员 猪精液冷冻技术操作流程 精液采集 质量检测 第一次稀释 降温、平衡 （15℃， 5℃ ） 第二次稀释 平衡 冷冻 保存 猪精液冷冻技术操作流程 颗粒法冻精的冷冻程序 1)新鲜精液在常温、等温条件下，用不含甘油的I液稀释，然后平衡0.5～2h; 2)缓慢降温至15℃维持4h，再从15℃经1h降至5℃; 3)用等温的含甘油的II液进行稀释。 4)稀释后用液氮熏蒸法制作冻精颗粒。 利用广口液氮罐，以聚四氟乙烯板作为冷冻面，冷冻面与液氮面距离为1～2cm，待冷 冻面充分预冷后，用预冷的滴冻管在氟板上连续等量滴冻。其始冻温度为-110～-125℃， 滴冻时间控制在60s内完成，加盖熏蒸平衡3～4 分钟后，浸入液氮中保存。 细管法和塑料袋法的冷冻程序 1)新鲜精液在室温下，用稀释液将精液按比例等温稀释，然后平衡0.5～2h。 2)将精液移入15℃条件下降温平衡3h。 3)在15℃条件下离心(800g，10min), 加入无甘油的I液，缓慢降到5℃，平衡 2h，加入含甘油的II液，然后分装。 4)程序冷冻仪冷冻： 初始温度为5℃，以3℃／min从5℃降到-5℃，再于-5℃条件下保持1min结晶，然后以 50℃／min从-5℃降到-140℃，然后投入液氮保存。 5)液氮熏蒸冷冻： 在广口液氮罐内，与液氮面距离5cm处，熏蒸20分钟，然后投入液氮保存。 影响猪精液冷冻效果的因素 个体的影响 个体对精液冻后效果影响极大。应用限制性片断长度多态(AFLP)分析控 制精子冷冻能力的基因，没有发现差异。差异的机制仍需要继续研究 冻前处理的影响 冷休克：可能原因是质膜中特别的组成成分所致。 猪精子膜磷脂酰胆碱的含量较牛低，而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的含量高 胆固醇/磷脂的比例低，且胆固醇的分布不对称，外膜的分布量大于内膜 离心：800g，10min 影响猪精液冷冻效果的因素 冷冻保存承载工具的影响 承载工具：颗粒、0.25mL、0.5mL小型细管和扁平细管； 5mL 的大型细管 5mL塑料袋。如FP(Flat-Pack，300mm×22mm×0.2mm)和MFP(a multiple Flat-Pack)。 冷冻解冻程序的影响 冷冻速率：30～50℃/min。解冻速率：1200～1800℃/min 冷冻 0.25mL微型细管：50℃/min、1.5％甘油浓度； 0.5mL小型细管：30℃/min、3％甘油浓度； 5mL大型细管：16℃/min 、3.3％甘油浓度。 解冻 0.25mL、0.5mL细管：50℃，12s或37℃，20s； 5mL细管：50℃，40s 5mL塑料袋：50℃，13s 影响猪精液冷冻效果的因素 稀释液的组成 大体上，包括糖，蛋白质，脂类，缓冲剂，冷冻保护剂和一些添加物质。 渗透压的影响 最佳渗透压：420～580mOsm/Kg为最佳渗透压 糖的影响 双糖（半乳糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖等） 单糖（尤其是果糖和木糖） 精子冻后活率。 配合使用效果比单一使用好 顶体完整率； 影响猪精液冷冻效果的因素 冷冻保护剂的影响 常用：甘油、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)、木糖醇、 乙酰胺、阿东糖醇等。 作用过程： （1）冲淡溶液中溶质盐浓度，细胞摄入盐量减少，由抗冻剂代替； （2）抗冻剂进入细胞，改变了胞内过冷状态，使胞内压接近胞外压，降 低了细胞脱水皱缩程度和速度； （3）抗冻剂进入细胞，缓解了精子在解冻时的渗透性肿胀引起的损伤。 效果：甘油保护效果最好，但有毒。 方向：联合使用，最终除去甘油 影响猪精液冷冻效果的因素 添加物的影响 缓冲：磷酸二氢钾、柠檬酸钠、Tris等； 抗菌：青霉素、链霉素等； 洗涤剂：OEP（氨基-钠十二烷基硫酸酯）、SDS（十二烷基硫酸钠）等； 抗氧化：维生素E、GSH（谷胱甘肽）等 激素类：PGF2a 其他：透明质酸、N-乙酰基-D-氨基葡糖等 影响猪精液冷冻效果的因素 抗氧化剂在猪精液冷冻保存上的应用研究 抗氧剂种类 效果 维生素E 200μmol水溶性VE提高解冻后精子的活力和线粒体的活性；2001000μmol α-VE能提高解冻后精子的活力，200μmol能保护精子脂质 的氧化 谷胱甘肽（GSH ） 二丁基羟基甲苯 （BHT） 获能状精子减少，体外受精率提高 添加0.2、0.4、0.8mmolBHT，解冻后精子存活率提高，脂质氧化降低， 体外受精的胚胎发育率得到提高（16：29，囊胚发育率） 过氧化氢酶（Catalase ） 单独或与SOD联合使用能提高解冻后精子存活率。与丙酮酸，巯基乙醇 一起添加，显著提高解冻后精子的活力，但是对精子的形态和存活时 间无影响。 超氧化物歧化酶（SOD ） 单独或与过氧化氢酶联合使用，提高解冻后精子存活率。 如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力 选择优良的个体 稀释液中要添加抗氧化的物质 BHT,GSH,SOD,过氧化氢酶，VE等。 输精时间要尽可能和排卵时间吻合 提高输精精子剂量 谢谢大家