Transcript 20100507_flowcytometry_analysis_123

Morphology
Flowcytometry
May 7, 2010

PB/骨髓血/ 骨髓/ CSF/LNs…

準備mononuclear cells

染色


◦ 一般3cc (heparin綠頭管)
◦ 須打洞者，約5cc
◦ <方法一> 加入Ficoll離心
◦ <方法二> 加入NH4Cl RBC lysis(無核RBC), wash
◦ PE螢光強, FITC螢光弱 (所以想看什麼盡量用PE)
福馬林固定
上機 (BD Canto-II可測8+2色螢光)
◦ 一般收10,000 events
◦ MRD收100,000 events
3


需打洞打洞，染色，固定，約需5cc的血
Tissue flow:
◦ 花生大小，切片完盡速丟入N/S或RPMI
◦ 須加入7AAD辨認細胞viability (染不上色為活細胞)

細胞存活:
◦ PB/BM blood可保存於室溫72小時
◦ Tissue可丟入N/S中，亦可丟入RPMI存活更久

Sorting:
◦ 目前借用中研院的sorter (Coulter)
◦ Sorting後的細胞為活細胞，可做cytogenetic、FISH、PCR
4
FITC
90° Side Scatter
(SSC)
GFP
“Granularity”
PE
Cy3
PI
APC
PerCP
PerCP-Cy5.5
PE-Cy7
2-16° Forward
Scatter (FSC)
“Size”
5
Tube
FITC
PE
PerCP
# 1 (control)
auto-fluorescence (不使用isotope) CD45
#2
HLA-DR
CD11b
CD45
#3
CD5
CD19
CD45
#4
CD56
CD38
CD45
#5
CD16
CD13
CD45
#6
CD15
CD34
CD45
#7
CD14
CD33
CD45
#8
CD7
CD56
CD45
#9
HLA-DR
CD34
CD45

檢體處理:
◦ Ficoll會損失大量neutrophil，無法準確評估mature myeloid cells
◦ 可能會有dying cells (各種marker都變弱)

Lab:
◦ 可能會有doublets (2 cells connected)
◦ 可能會有auto-fluorescence過強 (通常呈一直線)
◦ 可能會有bubbles (飄在頂端)

Analysis:
◦
◦
◦
◦
◦
可能會有over-compensation 或under-compensation
Plasma cells極端脆弱，評估%實在不準，僅供參考
APL很難判讀
Erythroid在分析上很困難
Megakaryocytes無法分析
7
華山派
劍宗
氣宗
Flow analysisFresh case
強調百分比%
(螢光control，
受限於cursor)
Flow analysisMRD
形態為重
(auto-fluorescence
control，
不拘泥於cursor)
需要初診斷原始資料
任何時刻偏離正常
才好判讀
就是異常
8
R2
R3
R1 NEC
R4
R5


記住位置
記住gating順序及意義 (R1, R2, R3, R4, R5)
10
11
Neu
Mye/Meta
Promye


DR-11b 呈一直線
CD16-CD13 呈鉤狀，且neutrophil應佔20%以下
12
Antigen Density
I
II
103
DR
102
101
III
IV
CD15
V
CD11b
CD33
CD45
CD13
CD34
CD117
CD16
CD10
Neutrophil Maturation
on/off, up/down, splicing
D
A
B
E
C
Phenotypic changes
occur together
F
Each patient unique
A
d
B
F
C
Cell death/ apoptosis
T-lym
NK
Eosinophil
Basophil
16
10 30 50 70 90
4
102
103
104
101
4
CD10
PE10 -->10
10
10
3
3
T
IV III
103
104
CD20 FITC -->
104
6
7
I
II
CD19+
III
1
I
1
102
103
2
2
II
102
SSC -->
4
SSC -->
CD45
PerCP
-->10
10
10
10
4
1
2
3
CD45
PerCP
-->10
10
10
10
101

2
1
1
101
120
FSC -->

Myeloid
CD19+
3
T
III, IV
II
I
CD19-APC
-->10
10
10
10
4
2
3
CD45
PerCP
-->10
10
10
10
10 4
2
3
SSC
-->
10
10
10 1
ML
LymphMono
IV
8
101
102
103
104
CD10 PE -->
101
102
103
9
104
CD20 FITC -->
記住B cells位置—stage 1234
記住CD20-CD10呈ㄣ字形
17
Antigen Expression
I
10 3
CD 34
TdT
III
CD 10
CD 45
CD 19
10 2
10 1
II
IV
FMC 7
CD 20
CD 22
CD 23
CD 5
B lymphoid maturation
18

Lineage infidelity
◦ Lymphoid on myeloid
◦ Myeloid on lymphoid

Maturational asynchrony
◦ Immature antigens on mature cells
◦ Mature antigens on immature cells

Antigeneic absence
◦ Loss of marker that should be present

Quantational abnormality
◦ Over-expression
◦ Under-expression
Wells DA, Benesch M, Loken MR et al, Blood, 2003, 102: 394-403
19

通則
◦ FSC-SSC的最左側有cell debris、dying cells、erythroid，不要gate
◦ Auto-fluorescence處無法判讀 (通常呈一直線)
◦ 要常常注意FSC (size)，大細胞常常是target cells
◦ 如果有多出異常marker，要注意是不是doublets
◦ Marker+會比marker-更重要，也比較容易將來當MRD的重要工具
◦ 報告cell %時，不同tubes可能會略有出入，以最有意義的那一管來報結果
◦ 使用NH4Cl RBC lysis後的cell percentage約等同於NEC
◦ 善用forward gating與backward gating，及其他gating strategy (選擇
適當的G1, G5…)來幫助判斷是否grouping/homegenous
◦ 想一想檢查MRD時:
 如果異常只出現在一管? 會是lab error?
 如果異常反覆出現在多管? 比較有信心
20

Myeloblast
◦ 與lymphoblast位置不同，size也較大
◦ CD34、DR用來辨認immature cells，CD34先消失，DR後消失 (所以沒
有CD34+/DR- cells)
◦ Myeloblast需與basophil鑑別 (DR-/11b+)
◦ Myeloblast如果有aberrant CD19+，常為M2

Myeloid maturation
◦ 依DR-11b與CD13-CD16的形狀來決定
◦ Promyelocyte多時 (如APL或maturation arrest)，fluorescence很強，
正常情況下promyelocyte約占8% (>15%表示left shifting)
◦ Neutrophil為CD15+，但此管的CD34+%比較不準
◦ CD16是GPI-anchor protein (for PNH)
21

Mono
◦
◦
◦
◦
DR+, CD14+是最重要marker，也會CD16+
CD33+ (強過myeloid)
CD16是GPI-anchor protein (for PNH)
Monocyte某一stage會帶有CD4+

Eosinophil

Basophil
◦ Eosinophil cap是一大特徵 (SSC-CD45)
◦ Eosinophil在FSC-SSC的最左方
◦ CD16-CD13的位置也很有特色
◦ SSC-CD45位置與myeloblast接近, 但DR-/11b+
◦ CD16-CD13的位置也很有特色
◦ (RBC與basophil沒有CD38)
22

Lymphoblast
◦ CD34+ 為stage 1，CD34-/DR+ 為stage 2 (1+2就是所謂
hematogone，在regeneration時常常很旺盛)
◦ TdT也是不成熟細胞的表徵 (出現在TB，極少在myeloid)
◦ 以cCD79a來辨認B-lineage, cCD3來辨認T-lineage
◦ BM裡沒有T-lymphoblast (所以任何BM immature blasts with
CD2/3/5/7...都是異常)，只有T-lymphocytes, NK cells
◦ CD1a為thymic antigen，是不成熟T細胞的表徵
◦ 大部分的B-ALL是CD10+ (Common ALL)
◦ 大約一半的B-ALL，CD45表現為dim，甚至negative
23

B-lymphocytes
◦ Light chain restriction大多用CD19+搭配κ或λ看，low grade較明顯，
DLBCL常常較dim
◦ DR+
◦ 正常人本來就有一小部分CD19+/CD5 dim的細胞 (所以可解釋CLL)

T-lymphocytes
◦ DR-，但activating T or NK會DR+ (所以DR+會出現在B及activating T
or NK，DR-的aberrant T cells得優先考慮T-lymphoma)
◦ CD45+，且比B強

NK cells
◦
◦
◦
◦
cCD3+，但是CD3-，CD5- (與T cell重要的不同)
CD2+，CD7+，CD16+，CD56+，11b+
位置也很特別，靠近myeloblast處 (SSC-CD45)
Activating T or NK會DR+
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
Plasma cells
◦
◦
◦
◦
因為很脆弱，%一般不準，只能看有無
CD38 bright(通常在天花板)，CD138+
Light chain restriction大多用CD38+或CD138+搭配κ或λ看
Myeloma cells: CD45 dim (所以落點特殊)，大多CD56+

如果CD25+，考慮HCL或ATLL

Erythroid

打洞

Tissue flow
◦ CD45-, CD38-, 幾乎全部的marker都陰性 (RBC與basophil沒有CD38)
◦ 很難判讀, 因此flow無法確診M6，也很難與MDS區分
◦ 打洞後需要另外拉control組才能判讀
◦ 活細胞為7AAD-，我們只判讀7AAD-的細胞
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