Enterobaktériumok, Coliformok, E. coli,

és

Salmonella kimutatása

3. gyakorlat

Indikátor mikrobák

   Enterobacteriaceae család (bélbaktériumok) Coliformok Escherichia coli

Salmonellák

Enterobaktériumok

Indikátor baktériumok, jelenlétük fekáliás szennyeződésre utal. Előfordulás: emberi és állati béltraktus, felszíni vizek, talajflóra Jellemzőik:, Gr-, rövid pálcák, általában peritrich csillóval mozognak, fakultatív anaerobok oxidáz negatívak NO 3 → NO 2 -vé redukálják glükózt bontják sav (esetleg gáz) termelés mellett

Enterobaktériumok kimutatása

Lemezöntés: VRBG-agar, (hagyományos lemezöntés + fedőréteg 4 ml) kristályibolya-neutrálvörös-epe-glükóz, 37 o C, 24 óra értékelés: 0,5 mm-nél nagyobb, ált. 2-3 mm-es, kerek, sötétvörös, csapadékkal körülvett (epesavas sók kicsapódnak, Na-dezoxikolát, Na-taurokolát) telepek Folyékony: BBG-leves: brillantzöld-glükóz-epe leves, 37 o C, 24 óra értékelés: zavaros és kisárgul → VRBG agarra

VRBG

OXIDÁZ-próba

1%-os parafenilén-diamin-oldat negatív: sárgás pozitív:

kékes

Pár másodperc - perc, A vas katalizálja! (üvegbottal, műanyag kaccsal végezhető)

Enterobaktériumok: negatív

FERMENTÁCIÓS próba

s Szőlőcukros magas agar (egy telepet leszúrunk), 37 o C, 24 óra

pozitív: sárga

, gázt termel Enterobaktériumok: az eredetileg piros színű agar főleg az alján sárgul ki (fak. anaerob), és homogén (mert mozog a szúrási csatornából)

Szőlőcukros magasagar

KATALÁZ próba

1 kacsnyi telep + pár csepp 10%-os H 2 O 2 tárgylemezen → +: pezseg Enterobaktériumok: pozitív

Coliformok

Laktózt 30°C-on egyidejű sav és gáz termelés mellett bontják

Escherichia (E. coli), Klebsiella (K. oxytoca), Citrobacter (C. freundii), Enterobacter (E. aerogenes) nemzetség – – Gr-, vaskos pálcák, epét vagy epesót tartalmazó táptalajban 30°C hőmérsékleten sav- és gázképződéssel bontják a laktózt, – – Többnyire a normál bélflóra tagjai, de van kivétel is (pl. E. aerogenes, amely soha nem fordul elő a bélben) Jelenlétük a friss fekáliás szennyeződést valószínűsíti

Klebsiella

Coliformok kimutatása

VRBL táptalaj (kristályibolya-neutrálvörös-laktóz-epe) – gátlóanyag: kristályibolya, Na-dezoxikolát – – savtermelés → udvar, min. 1 mm neutrálvörös → piros, precipitációs – 0,5 mm átmérőjű, sötétpiros (lilás-vörös) telepek Endo agar – gátlóanyag: Na-szulfit, fukszin laktóz → savak, aldehidek → aldehid+fukszin-szulfit → felszabadul a fukszin → vörös telepek (E. coli esetében ez olyan intenzív, hogy a fukszin kikristályosodik → fémes zöld fukszin-fény)

VRB agar

Endo agar

Coliformok kimutatása

BBL leves (brillantzöld-laktóz-epe leves), Durham cső, 30°C, 24-48 óra, zavarosodás+1/10 gáz → Coliform gyanús

Laurilszulfát-laktóz-leves

gátlóanyag: Na-lauril-szulfát Durham cső, 30°C, 48 óra → 1/10 gáz X-leves (szintetikus táptalaj) ammóniumsó, laktóz, puffer, nyomelemek

Kromogén Coliform agarok

Escherichia coli

Csak a bélcsatornában él, jelenléte mindig friss fekáliás kontaminációt jelez ( index mikroba) Önmagában többnyire ártalmatlan, vagy hasznos, egyes törzsei kórokozók (pl. E.coli O157 H7) Kimutatása során el kell különíteni a Coliformoktól

IMV(

E )

C próbák

Eijkman-próba: tenyészetből 1 kacsnyit BBL levesbe → 44,5°C 48 óráig vízfürdőben inkubáljuk → gyanús: zavaros + 1/10 gáz Durham csőben → VRBL agar próbákat → nutritív agarra szélesztjük az E. coli gyanús piros 2 mm átmérőjű telepet, és ezekkel végezzük el az IMVEC

I

MV(E)C próbák

Indolképzési próba: TRIPTONVÍZbe oltunk, 24 óra 44,5°C inkubáció 0,5 ml KOVÁCS-reagens (p-dimetil amino-benzaldehid amil-alkoholos sósavval savanyított oldata) 1 perc: + felszínen meggypiros gyűrű Triptofán + víz → piroszőlősav + indol → +KOVÁCS-reagens → ROZINDOL festék

I

M

V(E)C próbák

Metilvörös próba: PUFFEROLT + GLÜKÓZLEVES, 24 óra 37°C inkubáció 1-2 csepp METILVÖRÖS reagens : az egész leves színe élénkpiros – : az egész leves színe sárga A kevertsavas, és a butándiolos erjesztést végző baktériumokat különíti el egymástól (E.coli kevertsavas erjesztést végez)

IM

V

(E)C próbák

VP próba: PUFFEROLT GLÜKÓZLEVES, 24 + óra, 37°C inkubáció 0,2 ml 5%-os alkoholos naftol-oldat 0,1 ml 40%-os KOH 2 csepp 0.5%-os kreatin-oldat 2 óra múlva : tenyészet felső része kimutatására szolgál. piros A glükózt butándiolosan erjesztő baktériumok

IM

V

(E)C próbák

VP-próba

Glükóz → acetil-metil karbinol (acetoin) [ez a butándiolos erjedés egy köztes terméke] ↓

O

2

, KOH

diacetil ↓

+kreatin

piros szín

IMV(E)

C

próbák

Citráthasznosítási próba: ALAPLEVES, 4-6 óra inkubáció, 37°C-on, majd oltótűvel CITRÁTOS magas-ferde agarba szúrunk és a felületén is szélesztünk → 24-48 óra, 37°C inkubáció → +: eredeti zöld növekedés

KÉK

-re vált -: eredeti zöld szín marad, nincs baktérium (Brómtimolkék pH=6,8-on zöld, pH=7,6-on kék)

Az IMV(E)C próbák értékelése

Indol képzés

+ + +

Metilvörös próba

+ + + + -

Voges Proskauer próba

+

Citrát hasznosítás

+ + + + +

ELBÍRÁLÁS

Fekáltípusú

E. coli

Atípusos

E. coli

Citrobacter típusos Citrobacter atípusos Klebsiella v. Enterobacter Enterobacter atípusos

β-D-glükuronidáz pozitív Escherichia coli kimutatása

β-D-glükuronidáz enzim kimutatása MUG-al

MUG ( 4-metil-umbelliferil-D glükuronid): umbelliferil → β-D-glükuronidáz → umbelliferon (fluoreszkál) β-D-glükuronidáz enzime csak az E. colinak van (néhány Salmonella és Shigella törzstől eltekintve), a fluoreszcencia így nagy valószínűséggel E. coli jelenlétére utal. (E. coli O157:H7 nem képes ilyen enzimet termelni!) E. coli MPN: laurilszulfát leves + MUG

β-glükuronidáz-pozitív E. coli számának meghatározása

Minta (10 g/ml) + peptonvíz (90 ml), hígítási sor TBX (tripton-epe-glükuronid) agar lemezöntés (1 ml) Inkubálás 44± 1 o C 18-24 óra Pozitív telep: kék További megerősítő vizsgálatok nem szükségesek!

Salmonella

– – Enterobacteriaceae család Gram -, nem spórás – Önálló mozgásra képes, peritrich csillós kivétel: S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Typhi – – – – – 1 faj (Salmonella enterica), a szerotípusokat így írjuk: S. Enteritidis, S. Senftenberg, S. Typhimurium, S. Infantis, stb. (nagybetű, nem dőlt!!) Fakultatív anaerob Laktózt nem bontja, de Salmonella subgenus III (Arizona)-ba tartozó törzsek laktóz +, ONPG + Salmonella subgenus II-be tartozó törzsek között laktóz -, ONPG +

Általános tulajdonságok

Növekedés: 7-49,5°C, optimum: 35-37°C pH=3,8-9,5, optimum pH=7-7,5 Ellenálló képesség: – Fagyasztástól nem pusztul el – Alacsony vízaktivitás mellett (pl.: csokoládé: a w =0,3-0,5) – – – Az alacsony pH-t kevésbé bírja, mint az E. coli D idők:    60°C-on 2-6 perc 70°C-on <1 perc (alacsony vízaktivitáson extrém hosszú túlélés: D-idő 70°C-on 1050 perc) 0,1% ecetsav (pH=5,1) jelenlétében a növekedése gátolt

Salmonellák kimutatása

A Bizottság 2073-2005/EK rendelete az élelmiszerek mikrobiológiai kritériumairól

Kimutatási protokoll: MSZ EN ISO 6579 szerint Mintavétel: – 25 g (vagy egyes esetekben 10 g) minta – 100 cm 2 lemosásával vagy ismert mennyiségű öblítőfolyadék Minta előkészítése: homogenizálni, majd azonnal leoltani.

Szükség esetén 0-5°C-on 1 órát lehet várakozni .

Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás I.

25 g vizsgálati anyag + 225 ml előmelegített pufferolt peptonvíz ↓ H O M O G É N E Z É S ↓ 18±2 óra 37±1°C (elődúsítás) 0,1 ml ↓ +10 ml RVS dúsító 1 ml ↓ +10 ml MKTTn dúsító ↓ 24±3 óra 41,5±1°C ↓ ↓ 24±3 óra 37±1°C ↓

Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás II.

↓ ↓ XLD Másik táptalaj ↓ ↓ 24±3 óra 37±1°C ↓ ↓ XLD Másik táptalaj ↓ ↓ 24±3 óra 37±1°C Jellemző telepek kiválasztása ↓ Kioltás nem szelektív tápagarra (24±3 óra 37±1°C) Biokémiai próbák Szerológiai próbák

Dúsítók

RVS

:

Rappaport-Vassiliadis

dúsító Malachitzöld, Mg-klorid, NaCl, K-dihidrogén-foszfát, pH=5,2 ±0,2

MKTTn

: Müller-Kauffmann-tetrationát-novobiocin Na tioszulfát, marhaepe, brillantzöld, lugol-oldat, CaCO 3 , novobiocin, pH=8,2 ±0,2 Régen használatban volt még:

Bierbrauer féle leves:

Na tioszulfát, lugol-oldat, marhaepe, CaCO 3 , malachitzöld, brillantzöld

Szelenit-cisztin leves:

Na szelenit, laktóz

Szilárd táptalajok - XLD

XLD agar: Xilóz-lizin-dezoxikolát agar xilóz, laktóz, szacharóz (egyiket sem bontja!), L lizin-hidroklorid, Na-tioszulfát, ammónium vas(III)-citrát, Na-dezoxikolát (eredetileg vörös színű a táptalaj) – Xilóz, laktóz, szacharóz savvá bontása → sárga szín – – – H 2 S képződése → → szín (pH-változás) vas-szulfid → fekete szín kadaverin (dekarboxilálás) → telepek körül bíbor Na-dezoxikolát: Proteus telepek rajzásának gátlása, Gram+-okat gátolja Salmonella: telepek színe azonos a táptalaj színével

XLD

Egyéb szilárd táptalajok

BPL agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz agar lila, apró telepek, mivel pH nő (savra sárgulna) Brillantzöld gátolja a Gram+-okat, a S. Typhi-t és a Shigellákat BPLS agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz-szacharóz agar Sem a laktózt, sem a szacharózt nem bontja, így liláspiros telepeket képez. A laktóz negatív, de szacharóz pozitív zavaró flórát lehet vele kiszűrni.

Drigalski agar: sötétkék telep, mert Salmonella laktózból nem termel savat, sőt fehérjebontás miatt a pH megemelkedik Rambach agar: propilénglikol bontás, telep piros (savképzés neutrálvörös indikátor), egyes estekben színtelen: S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Typhisuis, S. Gallinarum SS agar: Salmonella-Shigella agar laktóz, marhaepe, Na-tioszulfát, Na-citrát, ammónium-vas(III) citrát, brillantzöld, neutrálvörös Szulfidképződés → fekete közepe lesz a telepeknek Laktózt nem bontja → vörös marad a táptalaj

BPLS

Az MSRV agar

MSRV agar: Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis agar – – A kimutatás a Salmonellák mozgékonyságán alapul: a Salmonella-migráció a félfolyékony tápközegben opálos udvaros növekedést eredményez.

Nagy háttérfertőzöttségű minták esetén (pl.: bélsár-minta, cloaca-tampon) a dúsítási folyamatban az RVS dúsító helyett használatos. Ilyenkor a dúsítás végén a rajzás széléről kell továbboltani.

Biokémiai megerősítés

TSI ferde agar: Triple-sugar-iron agar 10g laktóz, 10g szacharóz, 1g glükóz, Fe-citrát, Na tioszulfát, fenolvörös 1. Glükóz bontás: (TSI) savképzéssel + sav és gáz + 2. Laktózbontás: - , (TSI)

Salmonella enterica subsp. arizonae: + vagy – laktózbontás

3. Szacharóz bontás: - (TSI)

4. H 2

S termelés: +, (TSI)

Biokémiai megerősítés

RÖVID BIOKÉMIAI SOR

1. Glükóz bontás: + 2. Laktózbontás: általában 3. Szacharóz bontás: 4. H 2 S termelés: + 5. Karbamid bontás: 6. Indolképzés: 7. Lizin-dekarboxilálás: + 8. Voges-Proskauer próba: 9. ONPG-reakció: általában -

TSI agar

– TSI alja sárga: glükóz pozitív – TSI teteje piros: laktóz és szacharóz negatív – Fekete foltok a TSI agarban: H 2 S-termelés

Biokémiai próbák

5. Ureáz-próba: NH 3 (Karbamid bontás) (karbamid leves, 37°C, 24-48 óra) értékelés: karbamid bontás esetén a felszabaduló a fenolvörös indikátor színét rózsaszínre, később lilára változtatja

Biokémiai próbák

6. Indolképzés: (triptonvíz, 37°C, 16-24 óra, Kovács-reagens) értékelés: - sárga

Biokémiai próbák

7. Lizin-dekarboxilálás: (- : sárga lenne) + (lizin leves, 37°C, 20-24 óra) értékelés: + zavaros, bíborlila (brómkrezol-bíbor),

Biokémiai próbák

Karbamidbontás: negatív Lizin-dekarboxiláz: pozitív

Biokémiai megerősítés

8. Voges-Proskauer próba: -, CH 3 CH 3 CH-OH 40%-os KOH C=O C=O α-naftol, kreatinin C=O CH 3 CH 3 acetoin diacetil (piros)

9. ONPG-reakció -

(o-nitrofenil β-D-galaktopiranozid) :

Laktóz bontás

Laktáz (β-galaktozidáz) enzim laktóz bontása

ONPG reakció

(0,25 ml fiz. só, toluol, ONPG korong, 37°C, pár perc) értékelés: - nincs színváltozás, (+: sárga lenne)

Salmonella enterica subsp. arizonae: ONPG+

Szerológiai azonosítás

Önagglutináció kizárása:

1 csepp fiziológiás konyhasó oldat + kacsnyi törzs 1 perc múlva nagyítóval vizsgáljuk az agglutinációt, – Ha pozitív: szerológiai azonosítás nem lehetséges

Szerológiai azonosítás

O-antigén: anti-O szérum konyhasóoldatban (szomatikus antigén) Vi-antigén: anti-Vi szérum konyhasóoldatban (fehérje jellegű burok-antigén, az egész baktériumot beburkolja) H-antigén: anti-H szérum (H-flagellar ),

Az eredmények értékelése

Biokémiai próbák

Jellemző Jellemző Jellemző Nem jellemző Nem jellemző

Ön agglutináció

+ -/+ -/+

Szerológiai próbák

O-, Vi- vagy H-Ag pozitív Mindegyik negatív

Eredmény Salmonella

Önagglutináció miatt nem alkalmas vizsgálatra

Feltehetően Salmonella

O-, Vi- vagy H-Ag pozitív Mindegyik negatív

Nem Salmonella

Pozitivitás esetén

Döntő szerológiai azonosítás: A Salmonella vagy feltehetően Salmonella törzseket megerősítésre vagy szerotípus meghatározásra a – – Nemzeti Salmonella Központba (Országos Epidemiológiai Központ) vagy a Salmonella Referencia Központba (MGSZH) kell küldeni.

Salmonella bakteriofág

Fág-tipizálás