Transcript Prezentacja 1

ANALITYCZNE ASPEKTY
OZNACZENIA ENZYMÓW I ICH
PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA.
PROBLEMY ANALITYCZNE
OZNACZANIA BILIRUBINY
Gabriela Gołąb
III rok OAM
grupa A1
ENZYMY
Wielkocząsteczkowe,
w większości białkowe, katalizatory
przyspieszające specyficzne reakcje
chemiczne poprzez obniżenie ich
energii aktywacji
Enzym katalizuje reakcje
przekształcania substratów
w produkty, a szybkość tej reakcji jest
zależna od ilości aktywnego enzymy
w środowisku reakcji
ENZYMY
JEDNOSTKI AKTYWNOŚCI ENZYMÓW:
1 JEDNOSTKA (1 UNIT) – to taka ilość enzymu, która
w standardowych warunkach katalizuje powstawanie lub
rozpad 1mikromola substratu/produktu w ciągu 1 min
• 1 KATAL (1KAT)– to taka ilość enzymu, która w
standardowych warunkach przekształca 1 mol substratu
w ciągu 1s (jednostka zgodna z układem SI)
1 kat = 6∙107 U
1 U = 16,67∙10-9 kat = 16,67 nkat
ENZYMY
Apoenzymy – części białkowe enzymów
Koenzymy – drobnocząsteczkowe związki organiczne lub jony
nieorganiczne, których obecność w centrum aktywnym jest
niezbędna do katalitycznego działania enzymu (koenzym
silnie związany z cząsteczką białka = grupa prostetyczna)
Grupy prostetyczne i koenzymy (kosubstraty) ulegają
przemianie podczas reakcji enzymatycznej powracają do
pierwotnej postaci w wyniku reakcji wtórnej
Część białkowa – decyduje o:
• specyficzności w stosunku do substratu (jaki rodzaj
substratu ulega przemianie)
• kierunku reakcji
IZOENZYMY
Zakodowane w DNA, fizycznie odmienne postacie danego
enzymu – różnią się:
- wrażliwością na temperaturę
- wrażliwością na działanie różnych związków chemicznych
- powinowactwem do substratu
- ruchliwością elektroforetyczną
- właściwościami immunologicznymi
• katalizują tę samą reakcję
• występują w różnych typach komórek lub komparmentach
subkomórkowych
• przykłady izoenzymów: LDH, CK, ALP
IZOFORMY
Odmienne fizycznie postacie danego enzymu
powstające
w
wyniku
modyfikacji
potranslacyjnej (np. glikozylacja, hydroksylacja,
oksydacja)
OZNACZANIE ENZYMÓW
• pomiar ilości enzymu – po jego wyizolowaniu
z badanego materiału
• pomiar aktywności enzymu – na podstawie
szybkości katalizowanej reakcji uzyskujemy
informację o ilości enzymu
STANDARYZACJA OZNACZANIE
ENZYMÓW
• stosowanie jednej jednostki aktywności reakcji
enzymatycznej - katali
• stosowanie przez producentów do kalibracji metod co
najmniej drugorzędowego wzorca aktywności
enzymatycznej
• stosowanie szczegółowo opisanych metod
• aktywność enzymu musi być stała w czasie oznaczania
• mierzona aktywność enzymu musi być proporcjonalna
do rozcieńczenia próbki
• zakres roboczy metody musi odpowiadać zakresowi
wielkości aktywności enzymu mierzonej w laboratorium
• reakcję enzymatyczną należy zawsze prowadzić
w temperaturze 37°C
WARUNKI REKACJI ENZYMATYCZNEJ
• TEMPERATURA
termostabilność enzymu – najwyższa temperatura, w której nie
dochodzi jeszcze do termicznej inaktywacji enzymu
• pH I SIŁA JONOWA
Optymalne pH:
7-8 dla większości enzymów
1,5 pepsyna
4-6 fosfataza kwaśna
8-10 fosfataza alkaliczna
• STĘŻENIE SUBSTRATU
• INHIBITORY (substancje nisko- lub wysokocząsteczkowe lub jony)
WARUNKI REKACJI ENZYMATYCZNEJ
• AKTYWATORY
a. jony (Mn+2, Fe+2, Co+2, Zn+2, K+)
- Zn+2 – fosfataza alkaliczna i karboksypeptydaza
- Cl-, Br- - amylaza
- Mg+2 – kinaza kreatynowa
b. aktywatory prekursorów enzymów
c. koenzymy/kosubstraty
- NAD+, NADP+, FAD - dehydrogenazy
- fosforan pirydoksalu (PLP) – aminotransferazy
- pochodne witamin z grupy B
ENZYMY
1. Enzymy komórkowe (wskaźnikowe) – uwalniane w wyniku uszkodzenia błony
komórkowej lub rozpadu komórki
- mikrosomalne – GGT
- lizosomalne – ACP
- mitochondrialne – AST, CK, GLD
- cytoplazmatyczne – ALT, LDH, AST, CK
- błony plazmatyczne – ALP, GGT
2. Enzymy sekrecyjne – wydzielane do krążenia, gdzie spełniają swoją funkcję
- czynniki krzepnięcia i fibrynolizy
- acylotransferaza lecytyna:cholesterol (LCAT)
- cholinesteraza ChE (pseudocholinesteraza)
3. Enzymy ekskrecyjne – produkowane przez gruczoły i wydzielane do śliny, światła
przewodu pokarmowego, płynu nasiennego itp.
- amylaza
- lipaza
ENZYMY – WARTOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
•
•
•
•
•
Kwaśna fosfataza (ACP) - prostata
Alkaliczna fosfataza (ALP) – wątroba, kości
Amylaza - trzustka
Lipaza - trzustka
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) – wątroba,
serce
• Transaminaza Asparanginowa (AST) – wątroba,
serce
• Transaminaza Alaninowa (ALT) – wątroba, serce
• Kinaza Kreatynowa (CK) – serce , mięśnie, mózg
ENZYMY – STOSOWANE UKŁADY
POMIAROWE
1.
Test optyczny
2. Analogi naturalnych substratów
a. Fosfatazy ( p-nitrofenylofosforan, a-naftylofosforan
b. Amylaza (p-nitrofenylo-D-maltoheptozyd, 2-chloro-p-nitrofenyloaD-maltotriozyd
3. Substancje, z których pod wpływem enzymów powstają barwne
produkty reakcji (3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyna (TMB))
4. Przeciwciała – metody immunoturbidymetryczne,
radioimmunologiczne, immunoenzymatyczne
PRZYKŁADY ENZYMÓW
FOSFATAZA KWAŚNA - ACP
• Enzym należący do hydrolaz
• Katalizuje hydrolizę różnych estrów
fosforanowych
• Występuje w dużych stężeniach w gruczole
krokowym i w chorobach kości
• WZROST: choroby kości, rak prostaty,
nadmierny rozpad erytrocytów lub
trombocytów
FOSFATAZA ALKALICZNA (ALP)
•
Enzym wątroby, układu krążenia, układu kostnego
•
WZROST: choroby kości lub wątroby, nadmierna aktywność osteoblastów,
upośledzenie wydzielania żółci, choroby jelit
•
Wyróżniamy kilka form izoenzymów ALP :
ALPI – jelitowa
ALPL – tkankowa
ALPP – łożyskowa
LAP – leukocytarna
Metody rozdziału:
a.
elektroforeza żelowa
b. analiza produktów denaturacji
c.
inhibicja mocznikiem
d. techniki immunologiczne
AMINOTRANSFERAZY
• Enzymy wątroby, układu krążenia
• Niespecyficzne enzymy indykatorowe, biorące
udział w przemianach białek
• Transferazy – przenoszą grupy aminowe z
aminokwasów na alfa-ketokwasy
• PLP – koenzym
AMINOTRANSFERAZA
ASPARAGINIANOWA (AST)
• Występuje w cytoplazmie i mitochondriach
komórek wątroby, w mięśniach, kanalikach
nerkowych i erytrocytach
• Katalizuje reakcje : alfa-ketoglutaran + Lasparanginian -> L-glutaminian +
szczawiooctan
• Normalny zakres : 5-34 U/L
• WZROST: uszkodzenie wątroby, nerek, mięśni
szkieletowych, w zawale mięśnia sercowego
AMINOTRANSFERAZA
ASPARAGINIANOWA (AST)
OZNACZANIE:
• Metoda Karmena: L-asparanginian+alfaketoglutaron  L-glutaminian + szczawiooctan
• Szczawiooctan + NADH+ H+ jabłaczan + NAD+
• Mierzenie spadku absorbcji przy 340nm , który
jest proporcjonalny do aktywności enzymu
AMINOTRANSFERAZA ALANINIOWA
(ALT)
• Występuje w cytoplaźmie komórek wątroby
i w mięśniach poprzecznię prążkowanych serca
• Katalizuje reakcje : alfa-ketoglutaran + alanina
 glutaminian + pirogronian
• Normalny zakres : 10-40 U/L
• WZROST: uszkodzenie wątroby, mięśni
szkieletowych, w zawale mięśnia sercowego
AMINOTRANSFERAZA ALANINIOWA
(ALT)
OZNACZANIE:
Metoda Wróblewskiego i La Due’ego:
• L-alanina + alfa-ketoglutaron  L-glutaminian
+ pirogronian
• Pirogronian + NADH+ H+ mleczan + NAD+
• Mierzenie spadku absorbcji przy 340nm, który
jest proporcjonalny do aktywności enzymu
Znaczenie kliniczne aminotransferaz
WZROST AKTYWNOŚCI:
• 100x – ciężkie uszkodzenie wątroby
• 10-30x – ostre WZW
• 100-1000U/L autoimmunologiczne zapalenie
wątroby
• 1,5-5x – marskość wątroby
• 2-3x – zastój w krążeniu wrotnym, cholestaza,
przewlekłe choroby mięśni, ONN
WSKAŹNIK DE RITISA
•
•
•
•
Jest to stosunek aktywności aminotransferazy
asparaginowej do aminotransferazy
alaninowej (AST/ALT)
Prawidłowo:wkaźnik >1
>2 – alkoholowe zapalenie wątroby
<1 – ostre wirusowe zapalenie wątroby
>1 – przewlekłe zapalenie wątroby
>2 – zawał serca (2doba)
KINAZA KREATYNOWA (CK)
• Katalizuje odwracalną reakcję przenoszenia
grupy fosforanowej na ADP regenerując ATP
lub z ATP na kreatynę odbudowując zapasy
fosfokreatyny
• NORMA : 0-16 U/L
• Znaczenie kliniczne: choroby mięśni
szkieletowych, serca, choroby OUN, tarczycy
DEHYDROGENAZA MLECZANOWA
(LDH)
• Katalizuje odwracalną konwersję mleczanu w
pirogronianian i odwrotnie
• Kofaktor: NADH/NAD+
• NORMA: 80-285 U/L
• WZROST: hemoliza erytrocytów, rozpad
tkanek, zawał mięśnia sercowego (8-12h po
ustąpieniu bólu)
• Niewielki wzrost: choroby wątroby, anemia,
choroby nerek, dystofia mięśni
LDH - IZOENZYMY
•
•
•
•
•
LD1 – serce, erytrocyty
LD2 – leukocyty
LD3 – płuca
LD4 – nerki, łożysko
LD5 – mięśnie, wątroba
Metoda rozdzielania i oznaczania izoenzymów LDH:
a. Elektroforeza żelowa
b. Selektywne metody chemicznej inhibicji
c. Chromatografia jonowymienna
d. Immunostrącanie
AMYLAZA
•
•
•
•
Występuje w soku trzustkowym i w ślinie
Zapoczątkowuje proces trawienia skrobi
NORMA: 35-140 U/L
WZROST: zapalenie trzustki, urazy ślinianek,
alkoholizm, świnka, niewydolność nerek
• Metody oznaczania:
-metoda skrobiowa (test sacharogeniczny,
amyoklastyczny, chromogeniczny)
-metoda z innymi substratami
LIPAZA
• Hydrolizuje wiązania estrowa TG, czego produktami są
WKT i gliceryna
• NORMA: 0-62 U/L
• WZROST: choroby trzustki, perforacja wrzodu żołądka
• Metody oznaczania:
a. miareczkowanie kwas-zasada
b. turbinymetria
c. Spektrofotometria
d. test immunologiczny
BILIRUBINA
• Pomarańczowoczerwony barwnik żółciowy, produkt rozpadu hemu
hemoglobiny i innych hemoprotein
• Bilirubina jest związkiem słabo rozpuszczalnym w wodzie, stąd w
osoczu krwi transportowana jest w połączeniu z białkiem –
albuminą. Frakcja bilirubiny nietrwale związanej z albuminami
nazywana jest bilirubiną wolną lub pośrednią. Bilirubina wolna nie
przedostaje się do moczu, może jednak przenikać barierę krewmózg
• Bilirubina wolna transportowana jest do wątroby, gdzie ulega
dalszym przemianom do rozpuszczalnej w wodzie bilirubiny
związanej (bezpośredniej), przez co traci zdolność przenikania
bariery krew-mózg i przestaje być związkiem neurotoksycznym.
UDP-glukuronozylotransferaza sprzęga bilirubinę z kwasem
glukuronowym (glukuronianem)
HIPERBILIRUBINEMIA
Podwyższenie poziomu bilirubiny w surowicy we krwi
•
•
•
•
NORMA:
Bilirubina całkowita:
0,2 – 1,0 mg/dl (3 – 17 μmol/l)
Bilirubina sprzężona:
0,0 – 0,2 mg/dl (0 – 3 μmol/l)
Bilirubina niesprzężona:
0,2 – 0,8 mg/dl (3 – 14 μmol/l)
Bilirubina całkowita – noworodki
<12 mg/dl (205 μmol/l)
ZABURZENIA METABOLIZMU
BILIRUBINY
• HIPERBILIRUBINEMIA WOLNA
Fizjologicznie u noworodków
Hemoliza i zaburzenia erytropoezy
Zespół Criglera-Najjara (wrodzony niedobór
UGT)
Zespół Gilberta (zredukowana aktywność
transferazy lub zaburzony transport do
hepatocytów)
ZABURZENIA METABOLIZMU
BILIRUBINY
• HIPERBILIRUBINEMIA POŚREDNIA
 Cholestaza węwnątrzwątrobowa
wrodzona – zespół Dublin-Johnsona, zespół
Rotora
nabyta – marskość wątroby, alkoholizm, żywienie
pozajelitowe, posocznica
 Cholestaza zewnątrzwątrobowa
zamknięcie dróg żółciowych od wewnątrz
(kamienie żółciowe, nowotwory)
ucisk dróg żółciowych z zewnątrz
DIAGNOSTYKA RÓŻNICOWA ŻÓŁTACZKI
HEMOLITYCZNA
MIĄŻSZOWA
MECHANICZNA
BILIRUBINA
POŚREDNIA/BEZPOŚRENA
90 : 10 %
40 : 60 %
20 : 80 %
BILIRUBINA W MOCZU
brak
podwyższona
b.podwyższona
UROBILINOGEN
wzmożony
wzmożony
obniżony/brak
STERKOBILINOGEN
wzmożony
obniżony
obniżony/brak
KOLOR MOCZU
jasny
ciemny
b.ciemny
KOLOR STOLCA
ciemny
jasny
b.Jasny
AspAT/AlAT
norma
b.podwyższony
wzrost
ALP
norma
wzrost
b.podwyższony
GGTP
norma
wzrost
b.podwyższony
LDH
b.podwyższony
wzrost
wzrost
ŚWIĄD SKÓRY
brak
Możliwy
tak
METODY OZNACZANIA BILIRUBINY
1. WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA (HPLC)
pozwala rozdzielić bilirubinę na 4 frakcje:
a.
b.
c.
d.
alfa – frakcja bilirubiny wolnej
beta – frakcja bilirubiny sprzężonej (monoglukuronid bilirubiny)
gamma – frakcja bilirubiny sprzężonej (diglukuronid bilirubiny)
delta – frakcja bilirubiny sprzężonej, związanej kowalencyjnie z
albuminami; nie występuje u osób zdrowych i pojawia się przy
wysokich, utrzymujących się stężeniach bilirubiny sprzężonej;
utrzymuje się we krwi ok. 2 tygodni
Metoda HPLC nie ma szerokiego zastosowania w rutynowej
diagnostyce.
METODY OZNACZANIA BILIRUBINY
2. REAKCJA EHRLICHA – reakcja w której dwuazowany kwas
sulfanilowy reaguje z bilirubiną z wytworzeniem dwóch barwnych
izomerów (pH obojętne – kolor purpurowy, pH kwaśne lub
zasadowe – kolor niebieski
3. METODA DER BERGA I MULLERA – gdzie po dodaniu alkoholu
następuje przyspieszenie sprzęgania bilirubiny
frakcja BR reagująca bez dodatku alkoholu – BR bezpośrednia
frakcja BR nie reagująca bez dodatku alkoholu – BR pośrednia
*dodatek alkoholu powoduje zmętnienie
METODY OZNACZANIA BILIRUBINY
4. METODA JENDRASSIKA I GROFA
• BR całkowita – do roztworu dodaje się odczynnika
kofeionowo-benzoesowego, a następnie dwufazowy
kwas sulfanilowy. Reagują wszystkie formy BR.
Następnie dodaje się kwas askorbinowy, winian i HCl.
Mierzenie absorbancji 600nm
• BR związana – roztwór zakwasza się HCl i dodaje się
dwuazowany kwas sulfanilowy. Z odczynnikiem reaguje
tylko zestryfikowana BR i delta-BR. Następnie dodaje
się kwas askorbinowy, winian i odczynnik kofeionowobenzoesowy. Mierzenie absorbancji 600nm
METODY OZNACZANIA BILIRUBINY W
MOCZU
• Przy użyciu testów paskowych
• Ekspozycja na światło powoduje rozpad
bilirubiny
• Wyniki fałszywie dodatnie: NSLPZ
• Wyniki zaniżone: wysokie stężenie witaminy C,
azotyny, ekspozycja na światło
BILIRUBINOMETR
• Urządzenie do nieinwazyjnego przeskórnego
pomiaru poziomu bilirubiny u noworodków.
• Na pomiar nie ma wpływu płeć, wiek
urodzeniowy, rasa ani waga noworodka.
• Po zwirowaniu krwi należy zmierzyć
bezpośrednio absorbancje w
spektrofotometrze przy dwóch długościach fali
DZIĘKUJĘ ZA
UWAGĘ