Transcript Prezentacja 2

ANALITYCZNE ASPEKTY
OZNACZENIA ENZYMÓW I
ICH PRZYDATNOŚĆ
DIAGNOSTYCZNA.
PROBLEMY ANALITYCZNE
OZNACZANIA BILIRUBINY
Sylwia Studnicka
III rok OAM
Gr A/B
ENZYMY
• Enzymy są to w większości białka, zdolne do katalizowania reakcji,
w wyniku której następuje przekształcenie substratów w produkty
poprzez obniżenie energii aktywacji tej reakcji.
Podział enzymów
Ze względu na sposób przedostawania się do przestrzeni
pozakomórkowych:

Enzymy sekrecyjne:
- powstają w narządach miąższowych i wydzielane są do krwi, gdzie pełnią
prawidłowe funkcje;
- obniżenie ich aktywności w surowicy
= zaburzenia danego narządu.
Enzymy ekskrecyjne:
- syntetyzowane są przez komórki narządów wydzielniczych i zostają
wydzielone do śliny, do światła przewodu pokarmowego, itp.
- występowanie ich w surowicy wynika z przeszkód w odpływie płynów
wydzielniczych (żółci, soku trzustkowego).
Enzymy wskaźnikowe:
- nie występują w prawidłowej surowicy lub aktywność ich jest
niewielka w porównaniu z aktywnością wewnątrz komórek;
- dostają się do krążenia wskutek uszkodzenia komórek.
Podział enzymów
Wskaźnikowe
Sekrecyjne
niespecyficzne narządowo
specyficzne
narządowo
● e. glikolizy: heksokinaza,
fosfogliceromutaza,
izomeraza, PK, LDH
● e. cyklu pentozofosforanowego: dehydr.
Glu-6-P, transketolaza
● e. cyklu Krebsa:
dehydr. Izocytrynianowa,
Jabłczanowa, fumaraza
● e. przemian białek:
AspAT, AlAT, GGT, GLD
● e. przemian puryn:
dezaminaza adenozyny,
oksydaza ksantyny
● w wątrobie:
-dehydrogenaza
alkoholowa
-aldolaza Fru-1-P
-dehydrogenaza
sorbitolowa
-arginaza
●w mm poprzecz.
prążkowanych:
- aldolaza Fru-1,6-P2
- kinaza kreatynowa
•
•
•
lipaza
lipoproteinowa,
ceruloplazmina,
czynniki krzepnięcia i
fibrynolizy
Ekskrecyjne
● ślinianek: amylaza śl.
● trzustki: amylaza
trzustkowa, lipaza
trzustkowa, DN-aza, RN-aza
● stercza: fosfataza
kwaśna
● gruczołów
wydzielniczych żołądka:
pepsynogen
Izoformy
Są to odmienne fizycznie postacie enzymu, powstające w wyniku
jego modyfikacji potranslacyjnej:
zmiana fosforylacji
asocjacja z innymi białkami, agregacja
zmiana bocznego łańcucha węglowodanowego
częściowe rozszczepienie łańcucha
deaminacja
acylacja
utlenienie gr. SH
Izoenzymy (izozymy)
Fizycznie różniące się postacie danego enzymu, kodowane w DNA.
Katalizuję tę samą reakcję, ale występują między nimi różnice w:
- wrażliwości na temperaturę
- powinowactwie do substratu
- właściwościach immunologicznych
- ruchliwości elektroforetycznej
przykłady izoenzymów:
- dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
-kinaza kreatynowa (CK)
Standaryzacja metod
 Ochrona enzymu przed inaktywacją termiczną, degradacją
proteolityczną, utlenianiem;
 bufor testowy powinien chronić enzym przed hamowaniem
nadmiarem produktu;
 pomiar aktywności należy wykonywać w temperaturze 37°C;
 zakres roboczy metody powinien odpowiadać zakresowi
mierzonej aktywności;
 możliwość porównywania wyników;
Standaryzacja metod
 Stworzenie standardów metodycznych przez Międzynarodową
Federację Chemii Klinicznej – standardy IFCC; określenie wartości
referencyjnych
 Ujednolicenie jednostek aktywności enzymatycznej:
• Jednostka międzynarodowa – IU – ilość enzymu
przekształcająca 1 mikromol substratu w ciągu 1 minuty
• Katal – kat – ilość moli substratu przekształcanego w
produkt w czasie 1 sekundy przez 1 litr badanej próbki
Diagnostyka
Przyczyny zmian aktywności lub stężenia enzymów w surowicy:
proliferacja komórek;
biosynteza enzymów wewnątrzkomórkowych;
zmiana przepuszczalności błon komórkowych;
nasilony rozpad komórek (w wyniku procesów patologicznych);
upośledzona biosynteza enzymów sekrecyjnych w stanach ciężkich
uszkodzeń narządów miąższowych;
utrudniony odpływ płynów zawierających enzymy ekskrecyjne.
Zmiany te wywołane są przez:




urazy zewnętrzne → zmiażdżenie tkanki, oparzenia
urazy wewnętrzne → krwotoki
stany zapalne
procesy zwyrodnieniowe i martwicze
Lokalizacja enzymów w organellach
komórkowych
Lokalizacja enzymu
cytoplazma
mitochondria
retikulum endoplazamatyczne
Przykład
Aldolaza
LDH
AlAT
enzymy cyklu Krebsa
GLDH
AspAT
esterazy
reduktazy
fosfataza Glu-6-P
rybosomy
enzymy syntezy białek,
ceruloplazmina
esteraza cholinowa
lizosomy
proteazy
fosfatazy
kolagenazy
siateczka endoplazmatyczna
GGT
Diagnostyka a lokalizacja
Ze względu na umiejscowienie enzymów w komórce, stopień
uszkodzenia tkanki ma wpływ na poziom i rodzaj enzymów
komórkowych w osoczu.
● Lekkie uszkodzenia komórek powodują ucieczkę do osocza
białek i enzymów cytoplazmatycznych.
● W ciężkich uszkodzeniach komórek w osoczu pojawiają się
enzymy mitochondrialne.
KINAZA KREATYNOWA (CK) – enzym
wskaźnikowy
 Izoenzymy: CKMM, CKMB, CKBB
 w osoczu ludzi zdrowych CK MM stanowi 95% aktywności całkowitej (CKcałk)
 do obniżenia aktywności CK MM dochodzi w wyniku zmniejszenia masy mięśni
 oznaczanie aktywności CKcałk i CKMBcat pozwala na potwierdzenie wystąpienia
zawału w ciągu pierwszej doby tylko u ok. 70% chorych; skuteczniej wykrywa się
stan zawałowy we wcześniejszych etapach oznaczając izoformy sercowe białek –
troponiny I oraz T oraz mioglobinę; preferuje się także oznaczenia stężenia
CKMBmass
znaczny wzrost – ponad 5krotny
umiarkowany wzrost
zawał serca
zapalenie mięśnia sercowego
urazy mięśni
dystrofia mięśniowa
wstrząs
niewydolność krążenia
zapalenia mięśni po injekcjach
stany pooperacyjne
rozległe uszkodzenie tkanki nerwowej
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
 Izoenzymy LDH1 – LDH5 obecne są w mózgu, płucach, leukocytach, mm
szkieletowych, erytrocytach, mm sercowym, płytkach krwi, nerkach,
wątrobie.
 Swoistą izoformą dla mięśnia sercowego jest LDH 1 , o długim okresie
półtrwania (ok. 100 godzin); specyficzna dla wątroby – LDH5 ma krótki
czas półtrwania (do 10 godzin).
 W osoczu osób zdrowych dominuje izoenzym LDH 2.
duży wzrost aktywności
z przewagą LDH1, LDH2
duży wzrost aktywności
z przewagą LDH5
umiarkowany wzrost
aktywności
całkowitej (objaw
nieswoisty)
zawał serca (marker późny)
niedokrwistość
megaloblastyczna
ostre białaczki
ciężkie uszkodzenie nerek
choroby wątroby
choroby mięśni szkieletowych
zawał płuc i mózgu
procesy nowotworowe
FOSFATAZA ZASADOWA (ALP) – enzym
wskaźnikowy/ekskrecyjny
 Trzy izoenzymy, niespecyficzne tkankowo, kodowane są przez
jeden gen – w wątrobie, tkance kostnej i nerkach.
 Trzy izoenzymy – jelitowy, łożyskowy i komórek zarodkowych
kodowane są przez 3 geny swoiste tkankowo.
Izoenzym
wątrobowa ALP ↑
Przykład choroby
choroby wątroby, cholestaza
kostna ALP ↑
nowotworowe i nienowotworowe
choroby kości
jelitowa ALP ↓
przewlekłe choroby wątroby
żółciowa i makromolekularna ALP ↑
cholestaza i przerzutowe guzy
wątroby
łożyskowa ALP↑
nowotwory płuc, jajników, macicy,
jąder, układu żołądkowo-jelitowego
ALP komórek zarodkowych↑
nowotwory zarodkowe, przysadki,
grasicy
FOSFATAZA KWAŚNA (ACP) – enzym
wskaźnikowy/ekskrecyjny
 Izoenzymy: wątrobowy, nerek, stercza, kostny oraz izoformy
izoenzymu kostnego wytwarzane w neutrofilach, erytrocytach,
płytkach krwi, śledzionie.
 U dzieci w okresie pokwitania aktywność ACP jest 2-5 razy wyższa,
niż u dorosłych.
 U dorosłych zdrowych mężczyzn ok. 30% aktywności całkowitej
ACP stanowi aktywność izoenzymu stercza.
całkowita aktywność ACP ↑
choroba Pageta, przerzuty
nowotworowe do kości,
szpiczak, akromegalia,
osteoporoza, hemoliza
ACP stercza (PAP) ↑
przerost, zapalenie, rak
gruczołu krokowego
AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA
AMINOTRANSFERAZA ALANINOWA
AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA – AST, enzym wskaźnikowy
 zlokalizowana jest w cytoplazmie i mitochondriach komórek wątroby,
mięśni szkieletowych i serca, w erytrocytach, komórkach kanalików
nerkowych
 ma znaczenie w diagnostyce schorzeń wątroby
AMINOTRANSFERAZA ALANINOWA – ALT, enzym wskaźnikowy
 ALT występuje wyłącznie w cytoplazmie (w komórkach wątroby i nerek
wyższy poziom; niższy – w mięśniach; w niewielkich ilościach obecna w
komórkach wszystkich innych tkanek).
 ALT jest względnie swoista dla hepatocytów
 dogodny test skriningowy do wykrywania stanów zapalnych wątroby
(zakażenie HBV, HCV, alkoholizm, leki hepatotoksyczne)
 Aktywność AST i ALT w prawidłowej surowicy jest nieco wyższa u
mężczyzn, niż u kobiet; u noworodków jest większa 1,5- 2 razy, niż u
dorosłych.
AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA
AMINOTRANSFERAZA ALANINOWA
AST
wirusowe zapalenie wątroby
toksyczne uszkodzenie wątroby
nowotwory, białaczki, chłoniaki
zapalenie dróg żółciowych
Duży wzrost
zawał mm sercowego
ostre reumatoidalne zapalenie
mm sercowego
ciężka niewydolność krążenia
hemoliza
Łagodny
wzrost
ALT
wirusowe zapalenie wątroby
toksyczne uszkodzenie wątroby
zmiażdżenia wątroby, mięśni
ciężka niewydolność krążenia
przewlekłe choroby mięśni
choroby mięśni szkieletowych
niewydolność krążenia bez zawału marskość wątroby
przewlekłe zapalenia wątroby
żółtaczka zastoinowa
cholestaza
zapalenie trzustki
mononukleoza
ostra niewydolność nerek
DEHYDROGENAZA GLUTAMINIANOWA – GLDH,
enzym wskaźnikowy
 enzym zlokalizowany w mitochondriach wątroby
Duży wzrost aktywności
Umiarkowany wzrost
aktywności
WZW
śpiączka wątrobowa
przewlekłe agresywne
zapalenie wątroby
żółtaczka zastoinowa
pierwotny rak wątroby
wtórne nowotwory wątroby
GAMMA-GLUTAMYLOTRANSFERAZA – GGT,
enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny
 enzym zlokalizowany w błonach komórek o aktywnym transporcie
aminokwasów - nabłonku wątroby, trzustki, jelita dróg
żółciowych, kanalików nerkowych
 GGT obecna we krwi pochodzi głównie z wątroby
 aktywność w prawidłowej surowicy u kobiet nieco niższa, niż u
mężczyzn; duża aktywność u noworodków i niemowląt w
pierwszych miesiącach życia
GAMMA-GLUTAMYLOTRANSFERAZA – GGT,
enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny
 zmiany aktywności GGT wyraźnie korelują ze zmianami aktywności
ALP
 enzym podlega indukcji przez barbiturany, fenytoinę, estrogeny,
spożywany alkohol
Duży wzrost
aktywności
choroby zastoinowe wątroby
choroby dróg żółciowych
nowotwory wątroby
stany zapalne trzustki
nowotwory trzustki
przewlekły alkoholizm
ALFA-AMYLAZA – AMS, enzym ekskrecyjny
 W surowicy obecnych jest 8 izoenzymów pochodzących z trzustki,
ślinianek, błony, śluzowej jelita cienkiego, gruczołów mlecznych,
jajników, jąder
 Diagnostycznie wykorzystuje się oznacznie aktywności całkowitej
lub izoenzymu trzustkowego w surowicy i moczu w chorobach
trzustki i przewodu pokarmowego
 AMS jest białkiem małocząsteczkowym – podlega przesączaniu do
moczu (białkomocz przednerkowy) i jest dobrym
odzwierciedleniem poziomu we krwi; oznaczanie AMS w moczu
może być dogodne w monitorowaniu schorzeń trzustki.
ALFA-AMYLAZA – AMS, enzym ekskrecyjny
LIPAZA TRZUSTKOWA – LP, enzym ekskrecyjny
 enzym wytwarzany głównie w trzustce
 zmiany aktywności LP mogą być wywołane przez leki:
- heparyna, kodeina, opioidowe leki przeciwbólowe
zwiększają aktywność LP
- chinina hamuje aktywność LP
 wzrost aktywności LP w ostrym zapaleniu trzustki utrzymuje się
dłużej, niż aktywności AMS
 ze względu na swoistość narządową wzrost aktywności LP
charakteryzuje się prawie 100% czułością w rozpoznawaniu OZT.
Wzrost aktywności
ostre zapalenia trzustki
rak trzustki
cholestaza pozawątrobowa z
zajęciem trzustki
ELASTAZA1– enzym sekrecyjny trzustki
 Enzym nie ulega rozkładowi w jelicie cienkim i grubym, zawartość
oznaczana w ekstrakcie próbki stolca odzwierciedla poziom
elastazy wydzielanej do dwunastnicy.
 Duży spadek zawartości elastazy 1 poniżej normy wskazuje na
ciężką niewydolność zewnątrzwydzielniczą trzustki.
CHOLINESTERAZA – ChE, enzym sekrecyjny
wątroby
 enzym wydzielany z wątroby do krążenia
 do tej grupy należy AChE (rozkład acetylocholiny) –
acetylocholinesteraza w komórkach układu nerwowego, w
erytrocytach, płucach
 Znaczna zmienność międzyosobnicza aktywności ChE ogranicza
jej przydatność jako pojedynczego testu w rozpoznawaniu
uszkodzenia wątroby
CHOLINESTERAZA – ChE, enzym sekrecyjny
wątroby
 ChE jest użyteczna w monitorowaniu przewlekłych chorób
wątroby
↓ aktywności ChE
świadczy o znacznym
uszkodzeniu miąższu
wątroby i zahamowaniu
syntezy białek
↑ aktywności ChE
miąższowe choroby wątroby
zatrucia związkami fosfoorganicznymi
środki cytotoksyczne
wstrząs pourazowy
wrodzone niedobory enzymu
niedożywienie
zespoły nerczycowe, nadczynność tarczycy
okres rekonwalescencji po uszkodzeniu wątroby
Inne enzymy sekrecyjne
 Lipaza lipoproteinowa – różnicowanie zaburzeń gospodarki
lipoproteinowej.
 Enzymy krzepnięcia i fibrynolizy – czynniki II, V, VII, IX, X: pomiar
czasu protrombinowego jest miarą ich stężenia w surowicy.
 Ceruloplazmina – gromadzenie jonów miedzi w wątrobie
wywołuje spadek poziomu ceruloplazminy w osoczu.
Izoenzymy jako markery chorób
nowotworowych
 Wykrywane są częściej w stadiach zaawansowanych, niż we
wczesnych etapach,
 Monitorowanie ich aktywności w surowicy pozwala na ocenę
skuteczności terapii oraz na wczesne wykrycie nawrotu choroby.
Przykłady:
 Enolaza– enzym glikolityczny
 ALP
izoenzym wątrobowy
ALP ↑
frakcje rakowołożyskowe ALP ↑
guzy przerzutowe do
wątroby
guzy jajników, trzustki,
okrężnicy, piersi, płuc
 ACP - Wzrasta aktywność u ok. 50% chorych z zaawansowanym
rakiem stercza.
Izoenzymy jako markery chorób
nowotworowych
 GGT – wzrost aktywności w nowotworach wątroby, zwłaszcza z
towarzyszącą cholestazą.
 LDH
wzrost poziomu
LDH3
wzrost poziomu
LDH1, LDH2
nowotwory o dużej
dynamice wzrostu
chłoniaki, białaczki (zła
prognoza)
 PSA (prostate specific antygen) – proteza serynowa wydzielana
przez komórki nabłonkowe kanalików zdrowego stercza, ale
również przez nabłonek gruczolakoraka i raka stercza.
Bilirubina
Pomarańczowoczerwony barwnik żółciowy, będący produktem
rozpadu hemu hemoglobiny i innych hemoprotein
Bilirubina słabo rozpuszcza się w wodzie, dlatego w osoczu krwi
transportowana jest w połączeniu z albuminą
Frakcja bilirubiny nietrwale związanej z albuminami nazywana jest
bilirubiną wolną lub pośrednią. Bilirubina wolna nie przedostaje się
do moczu, ale może przenikać przez barierę krew-mózg
Bilirubina
Bilirubina wolna transportowana jest do wątroby, gdzie następują
jej dalsze przemiany do rozpuszczalnej w wodzie bilirubiny
związanej (bezpośredniej), przez co traci zdolność przenikania
przez barierę krew-mózg i traci właściwości neurotoksyczne
 UDP-glukuronozylotransferaza sprzęga bilirubinę z kwasem
glukuronowym (glukuronianem)
Bilirubina związana wydzielana jest aktywnie do żółci, skąd dalej
trafia do jelita. Jest tam przekształcana w barwniki żółciowe –
urobilinogeny (sterkobilinogeny) przy udziale enzymów
bakteryjnych
Właściwości bilirubiny
Bilirubina jest związkiem wrażliwym na działanie światła
naturalnego i sztucznego. W czasie ekspozycji na światło dochodzi
do jej izomeryzacji i utleniania
W diagnostyce laboratoryjnej ekspozycja na światło może wpłynąć
na wynik oznaczania bilirubiny, zaniżając jej stężenie, jeśli próbka
nie była chroniona przed światłem
Hiperbilirubinemia
Może być spowodowana upośledzeniem sprzęgania bilirubiny w
wątrobie lub zaczopowaniem przewodów żółciowych, a także
wytwarzaniem większej ilości bilirubiny niż jest w stanie wydzielić
do przewodów żółciowych prawidłowo funkcjonująca wątroba.
Przy stężeniu bilirubiny w osoczu przekraczającym 2-2,5 mg/100 cm3
dyfunduje ona do tkanek dając obraz kliniczny określany mianem
żółtaczki.
Przyczyną podwyższonego stężenia bilirubiny przedwątrobowej
może być też niedokrwistość hemolityczna, a także dziedziczne
zaburzenia sprzęgania bilirubiny w wątrobie.
Hiperbilirubinemia
Podwyższony poziom bilirubiny wolnej może być też
spowodowany uszkodzeniem miąższu wątroby, powstałym w
następstwie: WZW, marskości wątroby, zatruć, długotrwałego
stosowania hepatotoksycznych leków, czemu towarzyszy
upośledzenie wydzielania do żółci sprzężonej bilirubiny.
Hiperbilirubinemia spowodowana wzrostem stężenia bilirubiny
sprzężonej wiąże się z obecnością bilirubiny w moczu (bilirubinuria),
podczas gdy wolna bilirubina (skompleksowana z albuminą) nigdy
nie pojawia się w moczu.
Bilirubina jako marker w diagnostyce
laboratoryjnej
U zdrowych ludzi stężenie bilirubiny wynosi 1 - 1,3 mg/dl (17,1 - 22,2
μmol/l).
Stężenie to jest fizjologicznie wyższe u dzieci do 1 miesiąca życia,
zwłaszcza u wcześniaków, u których prawidłowe stężenie może
sięgać nawet do 16 mg/dl (273,6 μmol/l) w 3-5 dniu życia
Podwyższone stężenie bilirubiny określa się jako hiperbilirubinemię.
U chorych bilirubina sprzężona może przenikać do moczu. Taki stan
nazywa się cholurią
Metody oznaczania bilirubiny
WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA (HPLC)
pozwala rozdzielić bilirubinę na 4 frakcje:
– alfa – frakcja bilirubiny wolnej
– beta – frakcja bilirubiny sprzężonej (monoglukuronid
bilirubiny)
– gamma – frakcja bilirubiny sprzężonej (diglukuronid
bilirubiny)
– delta – frakcja bilirubiny sprzężonej, związanej
kowalencyjnie z albuminami; nie występuje u osób zdrowych i
pojawia się przy wysokich, utrzymujących się stężeniach
bilirubiny sprzężonej; utrzymuje się we krwi ok. 2 tygodni
Metoda HPLC nie ma szerokiego zastosowania w rutynowej
diagnostyce.
Metody oznaczania bilirubiny
REAKCJA EHRLICHA – reakcja, w której dwuazowy kwas
sulfanilowy reaguje z bilirubiną, w wyniku czego powstają dwa
barwne izomery (w pH obojętnym obserwujemy kolor purpurowy,
w pH kwaśnym lub zasadowym obserwujemy kolor niebieski)
Metody oznaczania bilirubiny
METODA JENDRASSIKA–GROFA (zmodyfikowana)
– wykorzystywana do bezpośredniego oznaczania bilirubiny
wolnej i sprzężonej
– dokonuje się dwukrotnie pomiaru kolorometrycznego przy
dwóch długościach fali – 400 i 460 nm.
– pierwszy pomiar pozwala określić stężenie bilirubiny
całkowitej
– drugi pomiar wykorzystuje różnicę w molowej zdolności
absorpcyjnej frakcji wolnej i sprzężonej
METODY OZNACZANIA BILIRUBINY W MOCZU
Przy użyciu testów paskowych
Bilirubina może krystalizować w moczu o kwaśnym pH, zwłaszcza
po schłodzeniu, a jej kryształy są widoczne podczas analizy osadu
moczu najczęściej w postaci żółto-brązowych igieł
Wyniki zaniżone: wysokie stężenie witaminy C, azotyny, ekspozycja
na światło
Wyniki fałszywie dodatnie: NSLPZ
Bilirubinometr
Jest to urządzenie do nieinwazyjnego, przezskórnego
pomiaru poziomu bilirubiny, również w czasie i po fototerapii
noworodków.
Na pomiar nie ma wpływu płeć, rasa, wiek urodzeniowy, ani
waga noworodka.
Pomiaru dokonuje się przez skierowanie białego światła w
skórę noworodka i badanie intensywności powracających fal o
określonej długości.
Znając spektralne właściwości składników skóry, można
wydzielić składniki zakłócające i określające koncentrację
bilirubiny.
Dziękuję za
uwagę