Transcript Enzymy komórkowe

Analityczne aspekty
oznaczania enzymów i
ich przydatność
diagnostyczna.
Problemy analityczne
oznaczania bilirubin.
Anna Sepioło
gr. B2 III OAM
Enzymy są to białka zdolne do
katalizowania reakcji przekształcenia
substratów w produkty poprzez obniżenie
energii aktywacji tej reakcji.
enzym
substrat
produkt
Klasyfikacja enzymów
enzymy
komórkowe
sekrecyjne
pozakomórkowe
ekskrecyjne
Enzymy komórkowe
Miejscem ich działania są komórki.
 Enzymy są związane z różnymi organellami
komórkowymi (cytoplazma, błona
komórkowa, mitochondria, lizosomy, ER).
 Pojawiają się w dużych ilościach po
uszkodzeniu narządów.
 Należą do nich m.in. AspAT, AlAT.

Enzymy pozakomórkowe

Są to enzymy produkowane przez komórki i wydzielane do
środowiska pozakomórkowego gdzie pełnią swoje funkcje:
Enzymy sekrecyjne:

po uszkodzeniach komórek (np. hepatocytów) zachodzi spadek
ich aktywności, ponieważ ich ilość zależy od syntezy w
rybosomach
 należą do nich min. czynniki krzepnięcia krwi oraz fibrynolizy,
esterazy cholinowe i lipaza lipoproteinowa.

Enzymy ekskrecyjne:
przeszkoda w normalnym odpływie różnych wydzielin
ustrojowych, takich jak: żółć, sok trzustkowy, ciecz sterczowa
czy ślina, powoduje zastój wydzieliny i przedostanie się
enzymów do krwiobiegu
 należą do nich enzymy soku trzustkowego, żółci oraz fosfataza
sterczowa

Izoenzymy

Formy molekularne enzymu mające zdolność
katalizowania reakcji enzymatycznej
charakterystycznej dla danego enzymu, ale
różniące się budową, ponieważ są kodowane
przez różne strukturalnie geny.

Strukturalne różnice izoenzymów odbijają się
w różnym stopniu na ich właściwościach, co
umożliwia jednocześnie ich rozróżnienie
(ruchliwość elektroforetyczna – LDH, inhibicja
przez L-winian).
Izoformy


Różne formy tego samego enzymu w surowicy
Powstają na skutek różnych rodzajów
modyfikacji potranslacyjnych cząsteczki enzymu:
 acylacja
 zmiana
bocznego łańcucha węglowodanowego
 częściowe rozszczepienie łańcucha
 deaminacja
 utlenienie gr. SH
 zmiana fosforylacji
 asocjacja z innymi białkami, agregacja
Warunki jakie powinien spełniać
enzym przydatny dla celów
diagnostyki klinicznej:





enzym powinien być obecny we krwi, moczu lub
innych łatwo osiągalnych płynach ustrojowych
względna łatwość oznaczania
znaczące różnice poziomów aktywności w stanie
patologicznym i normalnym
stabilność enzymu w płynie ustrojowym
pożądana cecha – specyficzność tkankowa
Cele diagnostyki enzymologicznej
rozpoznawanie
chorób
prognozowanie
monitorowanie
przebiegu chorób
Cele diagnostyki enzymologicznej
Pomiar uszkodzenia tkanek.
 Identyfikacja organu, w którym nastąpiło
uszkodzenie.
 Określenie rozległości uszkodzenia.
 Pomiar ciężkości uszkodzenia
komórkowego.
 Diagnostyka leżącej u podstaw choroby.
 Diagnostyka różnicowa choroby wewnątrz
organu.

Informacje diagnostyczne z:
Poziomu aktywności enzymu w próbce.
 Określenia wzorów enzymów (kilka
enzymów jednocześnie).
 Określenia aktywności enzymu w relacji
do innych enzymów.
 Monitorowania aktywności enzymu.
 Oznaczania izoenzymów.

Oznaczanie aktywności enzymów

Enzym katalizuje reakcję przekształcenia
substratów w produkty, a szybkość tej reakcji
jest zależna od ilości aktywnego enzymu
w środowisku reakcji.

Pomiar szybkości reakcji odbywa się w ustalonych
i ściśle kontrolowanych warunkach (pH,
temperatura, stężenie substratów, aktywność
innych enzymów biorących udział
w reakcji), w określonym przedziale czasu.
Jednostki aktywności enzymów


Jednostka enzymatyczna (IU) jest to taka ilość enzymu, która
w standardowych warunkach katalizuje przekształcenie 1
μmola substratu w ciągu 1 minuty, w warunkach optymalnych
dla danego enzymu.
Katal (kat) jest jednostka aktywności enzymatycznej
obowiązująca w układzie SI; to taka ilość enzymu, która w
standardowych warunkach przekształca 1 mol substratu w
ciągu 1 sekundy.
1 kat – 6x107 IU
1 IU = 1 μmol/min
1 kat = 1 mol/s
→ 60 mol/min → 6x107 IU
1 μkat/L = 60 IU/L
1 IU/L = 16,7 μkat/L
Typowe przyczyny zmian
aktywności enzymów we krwi
Co przeszkadza w diagnostyce
enzymologicznej?










Spożywanie pokarmów (↑AST, ALT, ALP)
Sposób pobrania materiału (pozycja ciała, staza)
Wiek (↑ i ↓), np. AST u kobiet
Ćwiczenia fizyczne (↑CK, AST, LDH)
Dieta
Ciąża (↑CK)
Alkohol (GGT)
Leki
Hemoliza
Stabilność enzymów
Pomiar szybkości reakcji enzymatycznej

Porównywalność oznaczeń
enzymatycznych jest możliwa tylko przy
stosowaniu tych samych warunków.

Warunki reakcji to kompromis pomiędzy
optymalnymi warunkami dla reakcji
chemicznej, wymaganiami technicznymi,
praktycznością i ceną.
Testy kinetyczne z fotometrycznym
pomiarem zmian absorbancji
Metoda dwupunktowa
 Metoda kinetyczna (ciągły pomiar)

Zasada pomiaru aktywności
enzymów
1) Kofaktory oznaczanych enzymów
2) Analogi naturalnych substratów
3) Substancje, z których pod wpływem
reakcji enzymatycznej powstają barwne
produkty, np. TMB
1) Kofaktory oznaczanych enzymów

Pomiar spadku/wzrostu absorbancji
pochodzący od powstającego/zużywanego w
reakcji enzymatycznej NADH lub NADPH.

NADH/NAD+ i NADPH/NADP+ są kofaktorami
używanymi przez wiele enzymów.

Redukcja NAD+ do NADH i NADP+ do
NADPH może być monitorowana przy 340 nm,
ponieważ forma utleniona nie absorbuje
światła przy tej długości fali.
Wykres absorbancji dla NADH przy różnych długościach fali
2) Analogi naturalnych substratów

Pomiar wzrostu absorbancji pochodzący od
powstającego p-nitrofenolu.

p-nitrofenol może zostać sprzęgnięty z wieloma
związkami chemicznymi, tworząc sztuczny
substrat dla oznaczanego enzymu.

Enzym katalizuje reakcję odszczepienia
p-nitrofenolu, który tworzy żółto zabarwiony
anion p-nitrofenolanowy.
Kalibracja oznaczeń aktywności enzymów


Wzorzec międzynarodowy aktywności enzymów – używany
przez firmy do kalibracji odczynników i obliczenia faktora.
W laboratorium – najczęściej użycie faktora podanego przez
producenta odczynnika
MRCM – Multi – Enzyme Reference Certified
Materials




Służą do kalibracji wartości docelowych we wzorcach
roboczych (dla zestawów odczynników) i materiałach
kontrolnych
Skomplikowana procedura przygotowania
Wykazują spójność pomiarową z referencyjną procedurą
(IFCC) i pierwszorzędowymi materiałami referencyjnymi
Enzymy pochodzą z różnych źródeł, są trwałe i kompatybilne
z materiałem ludzkim
Elementy standaryzacji oznaczeń
enzymów




Stosowanie zalecanych metod, szczegółowo
opisanych.
Temperatura 37°C.
Stosowanie jednostek SI (katale).
Stosowanie przez producentów do kalibracji
metod co najmniej drugorzędowego wzorca
aktywności enzymatycznej – zgodność z
zalecaną metodą referencyjną (IFCC) i wzorcem
pierwszorzędowym.
Główne enzymy mające znaczenie
kliniczne










Aminotransferaza asparaginianowa (AST, GOT)
Aminotransferaza alaninowa (ALT, GPT)
Kinaza kreatyny (CK)
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
Fosfataza alkaliczna (ALP)
Kwaśna fosfataza (ACP)
Enzymy dróg żółciowych (5’nukleotydaza, GGT)
Enzymy trawienne (amylaza, lipaza, trypsyna,
chymotrypsyna)
Pseudocholinesteraza
Dehydrogenaza G-6-P
Aminotransferazy – ALT, AST
Znaczenie kliniczne aminotransferaz





WZROST AKTYWNOŚCI:
100x – ciężkie uszkodzenie wątroby
10-30x – ostre WZW
100-1000U/L autoimmunologiczne zapalenie
wątroby
1,5-5x – marskość wątroby
2-3x – zastój w krążeniu wrotnym, cholestaza,
przewlekłe choroby mięśni, ONN
Wskaźnik de Ritisa
Jest to stosunek aktywności
aminotransferazy asparaginowej do
aminotransferazy alaninowej (AST/ALT)
Prawidłowo: wkaźnik nieco >1
 >2 – alkoholowe zapalenie wątroby
 <1 – ostre wirusowe zapalenie wątroby
 >1 – przewlekłe zapalenie wątroby
 >2 – zawał serca (2doba)
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)



Enzym uczestniczący w beztlenowym
metabolizmie glukozy (pirogronian → mleczan)
W organizmie człowieka istnieją dwa łańcuchy
polipeptydowe tego enzymu: H (heart) i M
(muscle).
Funkcjonalny enzym jest tetramerem i zawiera
różne kombinacje wspomnianych podjednostek:
– 1 (HHHH) serce, erytrocyty
– 2 (HHHM) leukocyty
– 3 (HHMM) płuca
– 4 (HMMM) nerki, łożysko, trzustka
 LDH – 5 (MMMM) wątroba, mięśnie szkieletowe
 LDH
 LDH
 LDH
 LDH
Fosfataza alkaliczna (ALP)


Enzym błonowy z klasy hydrolaz, katalizuje
reakcję defosforylacji różnych estrów
fosforanowych, optymalnie działa w środowisku
zasadowym.
W surowicy krwi pochodzi z następujących źródeł:
kostna – produkowana przez osteoblasty, bierze
udział w procesie mineralizacji kości
 frakcja wątrobowa – enzym zlokalizowany przede
wszystkim w komórkach nabłonkowych kanalików
żółciowych (wydalany z żółcią)
 frakcja jelitowa
 frakcja
Fosfataza kwaśna (ACP)



Enzym z klasy hydrolaz, katalizuje reakcję defosforylacji estrów
fosforanowych, optymalnie działa w środowisku kwaśnym
Fosfataza kwaśna obecna w surowicy krwi ludzkiej, może
pochodzić z następujących źródeł:
 osteoklasty‐ tzw. frakcja kostna
 gruczoł krokowy‐ tzw. frakcja sterczowa
 trzustka
 jelita
 nerki
 trombocyty i erytrocyty
Dodanie L‐winianu hamuje kwaśną fosfatazę sterczową, nie
działając na inne izoenzymy. Różnica między tymi dwoma
oznaczeniami (całkowitą kwaśną fosfatazą oraz niesterczową
kwaśną fosfatazą) daje poziom sterczowej kwaśnej fosfatazy.

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
wzrost aktywności we wczesnym okresie zawału mięśnia
sercowego oraz przy nadmiernej hemolizie

Kinaza fosfokreatyny (CK)
wzrost aktywności frakcji CK-MB jest czułym wskaźnikiem
martwicy zawałowej mięśnia sercowego

Fosfataza alkaliczna (ALP)
Marker cholestazy oraz schorzeń kości

Gamma – glutamylotransferaza (GGT)
Marker uszkodzenia alkoholowego wątroby

Pseudocholinesteraza
Spadek aktywności obserwuje się w chorobach
przebiegających z uszkodzeniem miąższu wątroby
Typowe zmiany aktywności we krwi enzymów uwolnionych
w wyniku zawału mięśnia sercowego
Diagnostyka chorób wątroby





aminotransferaza asparaginianowa (AST)
aminotransferaza alaninowa (ALT)
fosfataza alkaliczna (ALP)
-glutamylotranspeptydaza (GGT)
S-transferaza glutationowa
Znaczenie diagnostyczne: wirusowe zapalenie
wątroby, marskość wątroby,
żółtaczka mechaniczna
Inne tkanki





Mięsień sercowy
kinaza kreatynowa, aminotransferaza
asparaginianowa, dehydrogenaza mleczanowa
(zawał mięśnia sercowego)
Trzustka
-amylaza, lipaza (ostre zapalenie trzustki)
Prostata
fosfataza kwaśna (rak prostaty)
Mięśnie
kinaza kreatyny, aldolaza, fosforylaza glikogenowa
Kości
fosfataza alkaliczna
Bilirubina to organiczny związek chemiczny,
żółty barwnik – produkt degradacji części
porfirynowej hemu (głównie hemoglobiny –
80%) i w mniejszym stopniu innych białek
zawierających hem, np. mioglobiny,
cytochromów P-450, katalazy.
Powstawanie bilirubiny
hemoglobina
hem
Fe
pula Fe
całkowitego
globina
biliwerdyna
bilirubina
aminokwasy
Bilirubina występuje w dwóch formach:
Wolna = pośrednia, połączona z albuminami,
nierozpuszczalna w wodzie, nie może przenikać przez
błonę podstawną kłębuszków nerkowych i przedostawać
się do moczu; może natomiast przenikać przez barierę
krew – mózg i w dużych stężeniach działać
neurotokscznie.
Związana = bezpośrednia = sprzężona = glukuronian
bilirubiny, połączona z kwasem glukuronowym, nie łączy
się z białkami krwi, dzięki czemu z łatwością przedostaje
się przez błonę filtracyjną nefronu do moczu, jest
rozpuszczalna w wodzie. Po sprzęgnięciu z kwasem
glukuronowym traci zdolność przenikania bariery krewmózg i przestaje być związkiem neurotoksycznym.
Sprzęganie bilirubiny zachodzi w hepatocytach (enzym UDP – glukuronylotransferaza).
Glukuronizacja bilirubiny
Metabolizm bilirubiny
Bilirubina bezpośrednia (związana z kwasem
glukuronowym) jest wydzielana przez wątrobę do
żółci, a następnie przedostaje się do światła jelita,
gdzie na skutek działania bakterii ulega utlenieniu
do sterkobilinogenu. Sterkobilinogen wchłaniany jest
częściowo w dalszej części przewodu pokarmowego
z powrotem do krwi, skąd wychwytują go na nowo
hepatocyty (tzw. krążenie jelitowo – wątrobowe
bilirubiny). Kiedy wątroba nie jest w stanie
przetworzyć całego dostarczanego sterkobilinogenu,
na skutek uszkodzenia hepatocytów lub zbyt
dużego napływu substratu, jego część przedostaje
się do moczu jako urobilinogen.
hemoglobina
układ siateczkowo – śródbłonkowy wątroby, śledziony,
szpiku kostnego
bilirubina wolna
krew
bilirubina wolna
wątroba
wewnątrzkomórkowa bilirubina
wątroba
krew krążenia wrotnego
bilirubina związana
jelito – enzymy flory bakteryjnej
sterkobilinogen = urobilinogen
kał
sterkobilina
mocz
urobilina
Hiperbilirubinemia jest to zwiększenie
stężenia bilirubiny w osoczu. Może być
ona spowodowana:
zwiększonym
wytwarzaniem
bilirubiny
niezdolnością wydzielania
bilirubiny powstającej w
prawidłowych ilościach
przez uszkodzoną wątrobę
Przyczyny hiperbilirubinemii

Niesprzężona hiperbilirubinemia:
 Wzrost produkcji niesprzężonej bilirubiny z hemu
 Hemoliza
 Nieefektywna erytropoeza
 Szybki katabolizm masy czerwonych krwinek (noworodki)
 Zmniejszone
wątroby


dostarczanie niesprzężonej bilirubiny do
Prawostronna zastoinowa niedomoga serca
Przetoka żylna wrotno - próżna
 Zmniejszony
wychwyt niesprzężonej bilirubiny przez
błonę hepatocyta

Hamowanie niekompetycyjne (leki)
 Zmniejszone
przechowywanie niesprzężonej bilirubiny
w cytozolu (spadek białek Y i Z)

Sprzężona hiperbilirubinemia:
 Obniżone wydzielanie sprzężonej bilirubiny do kanalików:
 Dysfunkcje komórek wątroby
 Zapalenie wątroby
 Cholestaza wewnątrzwątrobowa
 Zespół Dubina – Johnsona
 Leki (estradiol)
 Obniżony przepływ żółci
 Kamienie żółciowe
 Rak przewodów żółciowych
 Zwężenie przewodów żółciowych
 Niedrożność przewodów żółciowych
 Pierwotne stwardniające zapalenie przewodów żółciowych
 Niedrożność wewnątrzwątrobowa
 Niektóre leki
 Ziarnica złośliwa
 Pierwotna marskość wątroby
 Guz wątroby
Zaburzone sprzęganie bilirubiny:
Żółtaczka noworodkowa
 Hamowanie sprzęgania bilirubiny
 Dziedziczne (zespół Criglera-Najjara)

 Typ
I (całkowity niedobór UDP – glukuronylotransferazy)
 Typ II (częściowy niedobór enzymu)

Dysfunkcja hepatocyta
Metody oznaczania bilirubiny
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
(HPLC) pozwala rozdzielić bilirubinę na 4 frakcje:
alfa – frakcja bilirubiny wolnej – 27% (8 – 55%)
beta – frakcja bilirubiny sprzężonej
(monoglukuronid bilirubiny) – 24% (8 – 37%)
gamma – frakcja bilirubiny sprzężonej
(diglukuronid bilirubiny) – 13% (7 – 21%)
delta - frakcja bilirubiny sprzężonej, związanej
kowalencyjnie z albuminami; nie występuje u osób
zdrowych i pojawia się przy wysokich, utrzymujących
się stężeniach bilirubiny sprzężonej – 37% (1 – 77%)
Metoda HPLC nie ma szerokiego zastosowania w rutynowej diagnostyce.
Metoda z odczynnikiem dwuazowym
(reakcja Ehrlicha)
Glukuronian bilirubiny ulega sprzęgnięciu
z solą dwuazoniową kwasu sulfanilowego
tworząc barwna pochodną – azobilirubinę.
 Glukuronian bilirubiny jest związkiem
rozpuszczalnym w wodzie, dlatego wchodzi
w reakcję bezpośrednio.
 Metoda pozwala na pomiar tylko bilirubiny
sprzężonej.

Metoda van der Bergha




Reakcja z odczynnikiem dwuazowym Ehrlicha (jw.).
Pozwala określić kolorymetrycznie stężenie
bilirubiny sprzężonej oraz całkowitej.
Rozpuszczalny w wodzie glukuronian bilirubiny
wchodzi w reakcję bezpośrednio, natomiast
bilirubina związana z albuminą wymaga
wcześniejszej hydrolizy (dodatek metanolu).
Frakcję pośrednią (wolną) wyliczano z różnicy
bilirubiny całkowitej i bezpośredniej.
Metoda Jendrassika – Grofa


Modyfikacja metody van ber Bergha.
Zamiast alkoholu stosuje się kofeinę i
benzoesan sodu, w obecności których bilirubina
dysocjuje od albumin.
Bezpośredni pomiar we krwi
noworodków


Bezpośredni pomiar spektrofotometryczny w
surowicy z krwi kapilarnej przy 454 nm.
Brak we krwi karotenów, które mogłyby
interferować.
Bilirubinometr



Urządzenie do nieinwazyjnego
przeskórnego pomiaru poziomu
bilirubiny, również w czasie i po
fototerapii noworodków.
Na pomiar nie ma wpływu płeć,
wiek urodzeniowy, rasa ani waga
noworodka.
Dokonuje pomiaru przez kierowanie
białego światła w skórę noworodka
i bada intensywność powracających
fal o określonej długości. Znając
spektralne właściwości składników
skóry, można wydzielić składniki
zakłócające i określające
koncentrację bilirubiny.
Bilirubina w moczu
Testy paskowe
 Świeża próbka moczu (ekspozycja na
światło → rozpad)
 Kwas askorbinowy i azotyny – wyniki
fałszywie ujemne

Normy
Bilirubina całkowita:
0,2 – 1,0 mg/dl (3 – 17 μmol/l)
 Bilirubina sprzężona:
0,0 – 0,2 mg/dl (0 – 3 μmol/l)
 Bilirubina niesprzężona:
0,2 – 0,8 mg/dl (3 – 14 μmol/l)
 Bilirubina całkowita – noworodki
<12 mg/dl (205 μmol/l)

Dziękuję za uwagę 