Transcript Exploration des Plaquettes

Exploration des Plaquettes par
cytométrie en flux
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Fonctions plaquettaires ?
• Enjeu pédiatrique
– Nouveaux nés, prématurés
– Thrombopénies néonatales fréquentes
– Gestes invasifs
• Enjeu chirurgical/Enjeu médico-légal
– Antiplaquettaires et sujets âgés
– Choix de l’anesthésie (générale/loco-régionale régionale)
– Risque hémorragique (technique chirurgicale)
• Enjeu cardio-vasculaire
– « Résistance » aux antiplaquettaires
Méthodes d’exploration disponibles en France
• Numération plaquettaire, distribution des volumes
plaquettaires
• Morphologie plaquettaire
• Temps de saignement (Ivy)
• Agrégation plaquettaire
• PFA-100TM : Sang total, cisaillement élevé
• Cytométrie en flux
• Thromboelastogramme : cytosquelette
• Thrombinogramme : activité procoagulante
• Point of care (POC)
GPIb
GPIIb/IIIa
Granule dense
Ca++
P
GP IV
ARN
Granule a
Signalisation
P-sélectine
Turn Over
Phospholipides
anioniques
Activité
procoagulante
Repos / activation plaquettaire
Pré-analytique :
-Citrate (le plus souvent)
-Délais courts < 2H
-Plasma Riche en Plaquettes (PRP)
Beckman Coulter
Morphologie plaquettaire
Surestimation des leucocytes :
21 Giga/L
Sous estimation des plaquettes :
7 Giga/L
Cytométrie en flux
Histogrammes de répartition
des volumes cellulaires
CD45+ : 10 Giga/L
CD61+ : 40 Giga/L
Sang Total
Platelet GP® Diagnostica stago
Calibration
• Sang total :
– Citrate : 0.109 M or 0.129 M
• Etat basal et réponse au TRAP
(60 µM)
• Anticorps primaires :
–
–
–
–
–
CD61 (GPIIIa) : clone F8
CD41a (GPIIbIIIa) : clone P2
CD42b (GPIba) : clone SZ2
CD62P (P-selectin) : clone Lyp20
CD49b (GPIa) : clone Gi9
aIIbb3
CHOIX DES ANTICORPS
fibrinogène
Ig agrégées
aIIbb3
collagène
Facteur
Willebrand
PAC-1
RIBS
IIa
collagène ADP
Épinéphrine
TxA2
FcgRIIa GPIb-IX-V
GPVI
CD41a
CD61
aIIb 1
non activée
Signalisation inside-out
affinité
avidité
Receptor induced Binding sites
Etat basal
TRAP
Hézard et al, Thromb Haemost 1999
INHIBITION DE
GPIIb-IIIa
Mab1 : compétitif de l’abciximab
Mab2 : non compétitif de l’abciximab
absolute number of free and total GPIIb/IIIa
60000
93%
87% 70%
54%
50000
*
*
40000
Mab1
Mab2
30000
20000
10000
0
Pre
abciximab
HNF
aspirine
avant
10min
4h
24h
48h
Angioplastie
± stent et ticlopidine
bolus 10 µg/kg
perfusion 10 µg/min
T10min
T4H T24H T48H T72H
Mab1 : compétitif de l’abciximab
Mab2 : non compétitif de l’abciximab
% d’inhibition du récepteur = (Mab2baseline-Mab2) / Mab2baseline
Hézard et al,Thromb Haemost 2001
P2Y12 ET PHOSPHORYLATION DE VASP
.
.
ADP
PGI2
P2Y1
Gq
PLC
P2Y12
Gi
Gs
Adenylate
cyclase
AMPC
VASP 239
–VASP 239
inhibition d’ aIIbb3 activation
P2Y12 ET PHOSPHORYLATION DE VASP
Modèle expérimental utilisant un inhibiteur spécifique de P2Y12 : AR-C69931MX
IR = 99%
IR = 38%
AR-C 6µM
PGE1
PGE1+ADP
IR = 1%
Basal
ADP
IR = 35%
PGE1
PGE1+ADP
PGE1
PGE1+ADP
% max d’Agrégation :
AR-C 0 : 85%
AR-C 0.06 µM : 20%
AR-C 6 µM: 11%
Basal
ADP
IR = 99%
AR-C 0.06µM
Basal
ADP
AR-C 0µM
IR = 0%
Témoin sain
Patient traité par clopidogrel
IR = 86 %
IR = 4 %
IR = 106%
IR = 100%
Platelets 2005
Standardisation
• Pré-analytique
– Modalités de prélèvement, type d’anticoagulant, délais autorisé
• Choix des réactifs
– Panel d’agonistes : qualité, concentrations
– Choix des anticorps
– Perméabilisation
• Analytique
– Délai immunomarquage/analyse
– Fenêtre FS/SS (Contrôle, état basal, état activé)
• Standardisation inter-laboratoires
– Outils de calibration
• Expression des résultats
Standardisation
PLAQUETTES CD41
Ajustement PMT
Billes fluorescentes
PLAQUETTES CD41