Påvisning av antistoff, identifisering og forlik

Magne Børset Avd. for immunologi og transfusjonsmedisin, St.Olavs hospital Institutt for kreftforskning og molekylær medisin, NTNU

Hvorfor påvise og identifisere irregulære blodtypeantistoff ?

• Hos pasienter: – For å gi RBC uten det antigenet som antistoffet er retta mot – unngå transfusjonsreaksjoner • Hos gravide: – oppdage og behandle hemolytisk sykdom hos fosteret 2

”Veilederen” sier om antistoffpåvisning: ”Før transfusjon må det undersøkes om pasienten har irregulære blodtypeantistoffer som kan destruere de transfunderte erytrocyttene.” Dette gjøres ved antistoffscreening og eventuell identifisering.

(Ikke tilstrekkelig med enkelt og utvida forlik.

Unntak: hastesituasjoner) 3

Før blodtransfusjon

Blodbank

Giver

•Ny ABO- & Rh typing

Transfusjonslab

Pasient Giver

•ABO- & Rh-typing (minst x 2) •Antistoffscreening (høyst 4 dager siden sist)

Forlik:

Donor-RBC + pasientserum

(ev. dataforlik)

4

Antistoffscreening

• Oftest tre celler med kjent fenotype • Dekker alle klinisk viktige antigener • IAT-teknikk • Automatisert ”type and screen” 5

”Veilederen” sier om antistoffscreening:

• Screeningcellene må dekke alle klinisk viktige antigener • Rh(C,D,E,c,e), Fy(a,b), Jk(a,b), MNSs-antigenene bør være homozygot forekommende på minst en av cellene. • Det må brukes lavione (LISS) indirekte antiglobulinteknikk.

6

Hvem screenes?

Pasienter ved innleggelse i sykehus: • Øyeblikkelig hjelp • Elektiv operasjon med blødningsrisiko • Forventet eller fryktet blødning Gravide: • Ved tidlig svangerskapskontroll (10 – 13 uker) • Rh-neg gravide også ved 32 og 36 uker Blodgivere: • Ved første gangs giving • Etter graviditet og/eller etter blodtransfusjon 7

Indirekte antiglobulintest (IAT) glassteknikk

Pasient serum Inkuber ved 37 o C vask x 3 Tilsett antiglobulin spinn Negativ: Ikke antistoff i serum Screening RBC Positiv: Antistoff i serum

8

Glassteknikk

Vanskelig å tolke svake reaksjoner. Graden av risting kan påvirke testresultatet.

9

IAT - gelteknikk

Positiv antistoffscreening.

10

Prinsippet ved gelteknikk

• Gelmatriksen (glasskuler/sephadex/polyacrylamid) virker som et såld • Store agglutinater fanges på toppen • Små agglutinater passerer delvis gjennom gelen avhengig av størrelse • Ikke-agglutinerte celler i bunnen

11

Gelteknikk

• Brukes ved de fleste immunhematologiske rutineprøvene • Blodtyping • Antistoffdeteksjon • Forlik • To slags geler • Reaktiv, d.v.s. tilsatt reagens, f. eks

blodtypeantistoff el. anti-human-globulin

• Nøytral 12

13

Gradering av reaksjoner i gelkort

-

++++

14

Gradering av reaksjoner i gelkort

Kan avleses manuelt eller maskinelt 15

Gradering av reaksjoner i gelkort

16

Positiv screening sier at antistoff er tilstede, men… • vi vet ikke hva antistoffet er rettet mot • Må sette opp identifikasjonprøve • Bruker et

PANEL

av røde testceller (ofte 11) med kjent fenotype (O-celler) • Tester pasientens serum mot disse cellene 17

18

19

Lokalt skjema i Trondheim 20

Lokalt skjema i Trondheim • Viktig informasjon: Blodtype/fenotype: • Sier noe om mulig antistoffspesifisitet Gravid?

• Risiko for HDN?

• Krever eget kontrollregime • Hvis påvist anti-D, fått profylakse?

Tidligere transfundert?

• Naturlig forekommende antistoff eller resultat av immunisering?

• Ble pas. transfundert med mistenkt antigen?

• Hvis transfundert siste tre måneder: fenotyping kan være upålitelig og reaksjon mot egne celler kan skyldes alloantistoff Blodgiver? • Må avregistreres?

21

Lokalt skjema i Trondheim • Viktig informajon: Resultat av screening: • IAT, ev. også med enzym eller ved 4 grader Positiv DAT?

• Ofte autoantistoff av varmetype hvis bare IgG+ • Ofte autoantistoff av kuldetype hvis bare C3d+ • Positiv hos nyfødte med risiko for HDN?

• Mixed field: Transfusjonsreaksjon?

Identifisering, ulike teknikker • IAT 37 grader • IAT mot enzymbehandla celler • Saltvannsteknikk: ved 4 grader uten AHG Titrering av antistoff • Farlige antistoff hos gravide • Parallelltitrering mot tidligere prøve fra samme pasient

A Identifisering • Mønster i reaksjonene avslører identiteten 23

Enzymbehandla panelceller

Rh MNSs P Lewis Lutheran Kell Duffy Kidd

D C E c e f V VS C W

M N S s

P 1 Le a Le b Lu a Lu b K k Kp a Js a

Fy a Fy b Jk a Jk b

Xg a 1 0 + 0 + + + 0 0 0 + + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 2 + + 0 0 + 0 0 0 + 0 + 0 + + + 0 0 + 0 + 0 3 + + 0 0 + 0 0 0 0 + + 0 + + 0 + 0 + + + 0 4 + 0 + + O 0 0 / 0 + 0 0 + + 0 0 0 + 0 + 0 5 0 0 + + + + 0 / 0 + 0 + + + 0 + 0 + 0 + 0 6 0 0 0 + + + + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 7 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 0 + W 0 + 0 + + 0 0 8 0 0 0 + + + 0 0 9 0 0 0 + + + 0 / 0 + + 0 + + 0 0 0 + 0 + 0 0 + + + + 0 0 + 0 + 0 W + 10 0 0 0 + + + 0 0 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 11 + + 0 0 + / 0 / 0 + 0 + 0 + 0 0 + + 0 + 0 + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 + + 0 0 + + 0 0 + + + + 0 + 0 + 0 + + + 0 + + + + + + + 0 + 0 + + + + + + 0 0 0 0 + + + + 0 0 0 + + + + 0 + + Auto Control Antigener som forsterkes etter enzymbehandling er markert med fiolett, mens antigener som svekkes er markert med blått 24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

IAT ENZ

0 0 0 0 0 0 1+ 0 0 0 1+ 0 0

Mulige problemer: Falskt negative prøver 1.

Klinisk viktige antistoff som svekkes over tid, men kan reaktivers Anti-Kidd  Viktig med høy sensitivitet (homozygote celler) 2. Alloantistoff adsorbert til blod som pas. har fått transfundert Falskt positive 1.

Pengerulldannelse (Rouleaux) (Mindre problem i gelteknikk) Gammaglobulinemi Pas har fått volumekspander 2. Fibrinkoagel Multiple antistoff Vanskelig å tolke reaksjonmønster Reaksjon med alle cellene i panelet Ev. også mot pasientens egne celler 25

Multiple antistoff?

a

Rh MNSs

P Lewis Lutheran

Kell Duffy Kidd

D C E c e f V VS C W

M N S s

P 1 Le a Le b Lu a Lu b K k Kp a Js a

Fy a Fy b Jk a Jk b

Xg a 1 0 + 0 + + + 0 0 0 + + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 2 + + 0 0 + 0 0 0 + 0 + 0 + + + 0 0 + 0 + 0 3 + + 0 0 + 0 0 0 0 + + 0 + + 0 + 0 + + + 0 4 + 0 + + O 0 0 / 0 + 0 0 + + 0 0 0 + 0 + 0 5 0 0 + + + + 0 / 0 + 0 + + + 0 + 0 + 0 + 0 6 0 0 0 + + + + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 7 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 0 + W 0 + 0 + + 0 0 8 0 0 0 + + + 0 0 0 + + 0 + + 0 0 0 + 0 + 0 9 0 0 0 + + + 0 / 0 + + + + 0 0 + 0 + 0 W + 0 0 0 0 + + 0 + 0 + 0 0 + + 0 + + + + 0 + + + + 0 0 + + + 0 + + + 0 + 0 0 + 0 0 0 + + 0 0 + + 0 + 0 + + 0 +

IAT

0 2+ 2+ 2+ (2+) 2+ 2+ 2+ 1+ 10 0 0 0 + + + 0 0 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 0 + 0 + + + 2+ 11 + + 0 0 + / 0 / 0 + 0 + 0 + 0 0 + + 0 + 0 0 + + 0 + + 0 Er alle positive reaksjoner like sterke?

heterozygote celler).

Auto Control 0 Indikerer at reaksjonene skyldes ett antistoff (obs. svakere reaksjon mot 26

Multiple antistoff?

Rh MNSs

P Lewis Lutheran

Kell Duffy Kidd

D C E c e f V VS C W

M N S s

P 1 Le a Le b Lu a Lu b K k Kp a Js a

Fy a Fy b Jk a Jk b

Xg a

IAT ENZ

1 0 + 0 + + + 0 0 0 + + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 2 + + 0 0 + 0 0 0 + 0 + 0 + + + 0 0 + 0 + 0 3 + + 0 0 + 0 0 0 0 + + 0 + + 0 + 0 + + + 0 4 + 0 + + 0 0 0 / 5 0 0 + + + + 0 / 0 + 0 0 + + 0 0 0 + 0 + 0 + 0 + + + 0 + 0 + 0 + 0 0 6 0 0 0 + + + + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 7 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 0 + W 0 + 0 + + 0 0 8 0 0 0 + + + 0 0 0 + + 0 + + 0 0 0 + 0 + 0 9 0 0 0 + + + 0 / 0 + + + + 0 0 + 0 + 0 W + 0 + 0 0 0 0 0 0 0 + 0 0 0 + 0 + 0 + 0 0 + 0 + + + + 0 + 0 0 0 + 0 + + + + + + + + + + + 0 0 + + + + 0 + + + 1+ 3+ 0 1+ 3+ 3+ 2+ 0 0 2+ 2+s 3+ 2+ 3+ 1+ 1+ 3+ 3+ 10 0 0 0 + + + 0 0 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 0 + + 0 + + 0 3+ 11 + + 0 0 + / 0 / 0 + 0 + 0 + 0 0 + + 0 + 0 0 + + 0 + + 2+ 2+ Auto Control 0 0 reaksjonsmønster Indikerer flere enn ett antistoff.

27

• • Hvordan identifisere multiple antistoff?

• Sette opp panelet ved ulike betingelser IAT Velegna for IgG-antistoff Saltvann Velegna for IgM-antistoff Enzymbehandla celler Øker sensitiviteten for noen antistoff, svekker den for andre • Sette opp flere paneler (nye celler) Hvis mistanke til et antigen, test mot celler som er negative for dette antigeneet Sende til spesiallaboratorium Nærmeste universitetssykehus - Ullevål - Bristol 28

Svake reaksjoner mot mange/alle celler i panelet, men

ikke mot autoceller

, kan skyldes…

Pengerulldannelse (Rouleaux) • Gammaglobulinemi • Pas har fått volumekspander Høytiter-lavaviditets-antistoff (HTLA) • Gjør titrering Antistoff mot høyprevalensantigen • F.eks. anti-Js b , -k, -Lu b Anti-HI: test prøven mot A 1 -celler 29

Rh MNSs P Lewis Lutheran Kell Duffy Kidd Xg a D C E c e f V VS Cw M N S s P 1 Le a Le b Lu a Lu b K k Kp a Js a Fy a Fy b Jk a Jk b Xg a 1 0 + 0 + + + 0 0 0 + + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 2 + + 0 0 + 0 0 0 + 0 + 0 + + + 0 0 + 0 + 0 0 0 + + + 0 + + + + + + 3 + + 0 0 + 0 0 0 0 + + 0 + + 0 + 0 + + + 0 4 + 0 + + O 0 0 / 0 + 0 0 + + 0 0 0 + 0 + 0 0 0 0 0 + 0 0 + + 0 + + 5 0 0 + + + + 0 / 0 + 0 + + + 0 + 0 + 0 + 0 6 0 0 0 + + + + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 7 0 0 0 + + + 0 8 0 0 0 + + + 0 0 9 0 0 0 + + + 0 0 / 10 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 0 + W 0 + 0 + + 0 0 + + 0 + + 0 0 0 + 0 + 0 + + + + 0 0 + 0 + 0 W 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 0 + 0 0 0 0 + 0 0 + + 0 0 + + + 0 + 0 0 + + + + + + 0 + 0 + 0 0 + + 0 0 + + + (1+) 1+ (1+) (1+) (1+) (1+) (1+) 1+ 1+ 1+

IAT

11 + + 0 0 + / 0 / 0 + 0 + 0 + 0 0 + + 0 + 0 0 + Høytiter-lavavidites-antistoff (HTLA): + 0 + + Auto Control 1+ 0 svake reaksjoner mot alle cellene - vedvarer gjennom mange fortynninger (titer minst 1 : 64) 30

Rh MNSs Lewis Lutheran Kell Duffy Kidd D C E c e f V VS Cw M N S s P1 Le a Le b Lu a Lu b K k Kp a Js a Fy a Fy b Jk a Jk b Xg a 1 0 + 0 + + + 0 0 0 + + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 2 + + 0 0 + 0 0 0 + 0 + 0 + + + 0 0 + 0 + 0 3 + + 0 0 + 0 0 0 0 + + 0 + + 0 + 0 + + + 0 4 + 0 + + O 0 0 / 0 + 0 0 + + 0 0 0 + 0 + 0 5 0 0 + + + + 0 / 0 + 0 + + + 0 + 0 + 0 + 0 6 0 0 0 + + + + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 7 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 0 + W 0 + 0 + + 0 0 8 0 0 0 + + + 0 0 0 + + 0 + + 0 0 0 + 0 + 0 9 0 0 0 + + + 0 / 0 + + + + 0 0 + 0 + 0 W + 10 0 0 0 + + + 0 0 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 0 0 0 0 0 0 0 + 0 0 + 0 + 0 + 0 + 0 0 + + 0 0 + + 0 0 + + + + + + + + + 0 + + + + + + 0 + + + + + 0 + 0 0 0 0 + + 0 + + 11 + + 0 0 + / 0 / 0 + 0 + 0 + 0 0 + + 0 + 0 0 + + 0 + + Auto Control Antistoff mot høyprevalensantigen (> 99 % av befolkningen er positive)

IAT

1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 0 31

Reaksjoner mot alle panelcellene,

inklusive autoceller

, kan skyldes…

Autoantistoff • Varmetype • Kuldetype

Autoantistoff kan maskere alloantistoff:

• Demaskeres ved autoadsorpsjon (Autoantistoffet bindes til pasientens RBC etter at cellenes bindingskapasitet er økt ved eluering eller forsterkning (PEG)) 32

Korrekt identifikasjonen av antistoff?

• Etter identifisering må pasientens celler types for mistenkt antigen • Dersom cellene er positive for antigenet: • identifikasjonen er feil (OBS unntak: • anti-D hos partiell D • autoantistoff) • Dersom negative: • identifikasjonen aksepteres • ved transfusjon velges blod som er negativt for antigenet 33

Rekombinante blodgruppeantigener til antistoffidentifikasjon

• Ved multiple antistoff: – Reagerer bare med ett av antistoffene – Kan også brukes til å eluere vekk klinisk irrelevant antistoff for å identifisere maskerte antistoff • Ved antistoff mot høy-prevalensantigener eller sjeldne antigener – Slipper å langtidslagre RBC med spesielle fenotyper • Én brønn, ett antigen • Lenger holdbarhet på reagenser enn på celler Curr Opin Hematol 2009, 16:473 –479 34

Assayformater

• Fastfaseassay – ELISA – Beadbaserte metoder: • Luminex • Flowcytometer • Cellebaserte assay – Antigener som passerer membranen flere ganger 35

Curr Opin Hematol 2009, 16:473 –479 36

Problemer med rekombinante blodgruppeantigener

• Går én eller flere ganger gjennom membranen?

– Multipassasjeproteiner må uttrykkes på membranoverflate av celler (Rh, Duffy, Kidd) – Hvordan forhindre falske positive p.g.a. HLA-antistoff?

• Posttranslasjonelle modifikasjoner – Glykosyleringer – Disulfidbindinger – Må gjerne bruke eukaryote ekspresjonssystemer • Interaksjon mellom flere membranproteiner 37

Blodforlik: p asser giver og mottaker sammen?

• Enkelt forlik

prøve

• Utvida forlik

påviser IgM i pasientplasma rettet mot givers RBC (saltvann ved romtemperatur) • Test på ABO-forlikelighet • Positivt enkelt forlik skyldes oftest forbytting av påviser IgG i pasientplasma rettet mot givers RBC (IAT ved 37 0 C) 38

”Veilederen” om enkelt forlik:

Før transfusjon av erytrocytter skal det være utført enkel forlikelighetsprøve. Prøve som ikke er eldre enn 4 døgn.

…… kan erstattes av elektronisk forlik. 39

”Veilederen” om forlik:

Ved transfunsjon til barn yngre enn ei uke: forlik mot mors serum (om mulig).

Til barn mellom 1 uke og 3 måneder er to alternativ likeverdige: • Utvida forlik mot mors serum • Barnet kan få ABO- og Rh(D)-typelikt blod om DAT er negativ hos barnet, og det ikke er påvist irregulære blodtypeantistoffer hos mor.

40

”Veilederen” om elektronisk forlik:

……kontroll i edb-systemet av at transfusjonsblodets ABO-type er forlikelig med mottakerens ABO-type. Transfusjonsblodets ABO-type skal være kontrollert ved aktuelle blodgivning.

Pasienten skal være typet i prøve ikke eldre enn 4 døgn 41

”Veilederen” om utvida forlik (modifisert)

Før transfusjon til pasient med antistoff: alltid utvida forlik.

Blodgiveren skal være typet negativ to ganger for antigenet. Én typing er tilstrekkelig dersom antistoffet denne gangen reagerte med alle testcellene som var positive for antigenet. Ved Kidd-antistoff bør typingen alltid utføres to ganger.

42

Biologisk forlik til pasienter med autoantistoff

• Kan utføres hvis pasientserum ikke lar seg forlike med

noen blodenheter og pas. må ha blod

• Gi mest mulig fenotypelikt blod • Transfunder 10 – 20 ml raskt, deretter reduseres

dråpetakten til et minimum, og pas. observeres for tegn til transfusjonsreaksjon. Deretter normal hastighet under kontinuerlig oppsyn.

TAKK!

43