Transcript 2011_03_17_blodtypeserologiske metoder

Teknikkar:
Blodtypeserologiske metodar
Guro Kristin Melve 18.12.08/Tor Hervig
17.03.11
AIT Haukeland Universitetssjukehus
Case 1
• Ved nasjonal kvalitetskontroll ble det sendt
ut et serum som inneholdt anti-D – og det
ble forventet at det skulle bli en ++ (2+)
agglutinasjon av Rh(D) positive
erytrocytter det skulle utføres forlik mot.
• Alle deltakende blodbanker unntatt en (1)
påviste uforlikelighet
Case 2
• En 61 år gammel kvinne ble dårlig med
blodtrykksfall, pulsstigning og pusteproblemer 1
time etter avsluttet transfusjon. Tross
intensivmedisinsk behandling døde hun 8 timer
senere.
• Det var utført forlik med indirekte
antiglobulinteknikk før transfusjon: Negativt
• Ved utredning av transfusjonsreaksjonen ble
konklusjonen hemolytisk transfusjonsreaksjon
pga anti-K
Case 3
• På mandag ble det forlikt 20 enheter
erytrocyttkonsentrat til en kirurgisk pasient.
12 enheter ble transfundert, 8 enheter ble
oppbevart i blodskap, reservert til
pasienten
• Påfølgende fredag ny operasjon; de 8
reserverte enhetene blir brukt. Pasienten
utvikler alvorlig hemolyse, som medvirker
til at pasienten dør.
Case 4
Screeningfunn
Celler
I
Celler
II
Celler
III
Identifisering
IAT
(+)
Uident.
PEG-IAT
++
anti-K
Grunnprinsipp: Agglutinasjon
•
Definisjon: Minimum tre erytrocyttar bundne
saman av antistoff i eit nettverk
•
Totrinnsprosess:
1.Antigen-antistoffbinding
2.Nettverksdanning
Kva påverkar antigenantistoffbinding (trinn 1)?
•
•
•
•
•
•
•
Struktur
Ladning
Temperatur
pH
Inkubasjonstid
Ionestyrke
Antigenantistoffmengde
Kva påverkar
antigenantigenKva påverkar
antistoffbinding?(trinn 1)?
antistoffbinding
onestyrke:
etapotensialet
ionediffusjonslag
ladde
■ negativt
• Ionestyrke
erythrocyttar fråstøyter
– NISS
kvarandre
– LISS
6
stasjonært lag
av positive ioner
negativt ladd
erythrocytt
Guro Kristin Melve
Kva påverkar nettverksdanning
(trinn 2)?
• Antistoffa sine
eigenskapar
• Antigena sine
eigenskapar
• Serum/celleratio
• Avstanden mellom
erytrocyttane/
zetapotensialet
Antistoffa sine eigenskapar
IgM- fleire antigenbindande
sete – større diameter (35nm)gir agglutinasjon ved
saltvannsteknikk
IgG- berre to antigenbindande
sete – mindre diameter (14 nm)gir sjeldan agglutinasjon ved
saltvannsteknikk
Antigena sine eigenskapar
•Lokalisasjon
•Doseeffekt
Agglutinasjon
Serum/celleratio og agglutinasjon
Antistoffoverskot:
Agglutinasjon kan
oppnåast ved
serumfortynning
Likevekt:
Forholdet mellom
Serum og celler er
ideelt
Antistoffunderskot:
Agglutinasjon kan
oppnåast ved å auke
serum/celleratio
Antigenkonsentrasjon
Avstanden mellom
erytrocyttane/zetapotensialet
Zeta potensial
• Negativt ladde
erytrocyttar omgir seg
med positivt ladde
ioneskyer
↓
Fråstøytande krefter
verkar mellom
erytrocyttane
Metodar som effektiviserer
agglutinasjonsreaksjonen
• Auka serum/celleratio
• LISS
• Indirekte
antiglobulinteknikk
• Enzymmetodar
• Polyetylene glykol
• Polybrenemetodar
• Albuminmetodar
IAT - prinsipp
• Antistoff med
spesifisitet mot Fcdelen av
immunglobulin lagar
bruer mellom
antistoffsensibiliserte
erytrocyttar→
agglutinasjon
IAT - prinsipp
• Ein del antistoff gir
binding av C3 til
erytrocyttane →
polyspesifikt AHG
inneheld også anti-C3
→ agglutinasjon av
C3-dekka celler
IAT
• Negativ IAT
Antihumanglobulinreagens (AHG)
Opphav
Spesfisitet
REAGENS
POLYKLONALT
MONOKLONALT
ANTI-IGG
ANTI-C3d
ANTI-C3b
Polyspesifikk
+
+
+
+
+
Anti-IgG
+
+
+
-
-
Anti-C3d +
anti-C3b
+
-
-
+
+
Anti-C3d +
anti-C3b
-
+
-
+
+
Kva slags AHG-reagens?
• Anti-komplement aktivitet viktig ved direkte
antiglobulintest (DAT), særleg ved
diagnostikk av autoimmun hemolytisk
anemi
• Ved forlikstesting og antistoffidentifisering
er rein anti-IgG aktivitet å føretrekkje.
Unngår ”støy” av klinisk irrelevante
(kulde-)antistoff.
IAT
1. Inkubasjon erytrocyttar-serum
2. Avlesing
3. Vask
4. Anti-IgG
5. Avlesing
6. Kontroll med sensibiliserte
celler Inkubasjon
IAT- kvalitetskontroll
1. Tilsetjing av sensibiliserte celler
•
•
AHG tilsett?
Adekvat vask?
2. Positiv kontroll
•
Adekvat anti-IgG-reaktivitet?
3. Negativ kontroll
•
Adekvat AHG-spesifisitet?
Feilkjelder IAT – falskt negative
reaksjonar
• Nøytralisering av AHG-reagens
– For dårleg vasking
• Obs ved auka serummengde
– Kontaminasjon av AHG-reagens
•
•
•
•
Unøyaktige volum- pipettering
For kort inkubasjonstid
Ujevn lagringstemperatur AHG-reagens
Enkelte anti-Jka/Jkb berre oppdaga med
polyspesifikt reagens
• Kontroll med sensibiliserte erytrocyttar viktig
Feilkjelder IAT – falskt positive
reaksjonar
• Agglutinasjon av celler før vask
• Celler med positiv DAT: falsk positiv
reaksjon
• ”Uspesifikk” binding av komplement
Enzymmetodar
•
•
•
•
Papain (papaya)
Ficin (fiken)
Bromelin (ananas)
Trypsin ( svineventrikkel )
Enzymmetodar (papain)mekanismer og fordeler
• Proteolytisk
• Beste metode for
påvising av Rhantistoff
• Sensitiv for påvising
av Kidd-antistoff
• Rask metode
Enzymmetodar- feilkjelder:
• M,N,S,s,Fya,Fyb,Yta,Xga,Ge, Ch,
Rg,JMH, Inb,Knops,Cromer, Tn, Pr blir
denaturert
• Forsterkar ein del klinisk lite viktige
kuldeantistoff: anti-Lea,anti-Leb,anti-I,
anti-P1
• Falsk positive og negative reaksjonar
Polyetylene glykol
• PEG
– Fjernar vassmolekyl?
– Sensitiv
– Falsk
positive/(negative)
Polybrene- og albuminmetodar
Polybrene
Albumin
Gelteknikk og mikrotiterplateteknikk
Solid-phase systems og ELISA
Automatiserte
agglutinasjonsmetodar
Val av teknikk
• Problemstilling
• Hastegrad
• Teknisk og medisinsk
ekspertise
• Økonomi
• Konvensjonar
• Kombinasjon av ulike
teknikkar
– Skreddarsydd
utgreiing
– Rasjonelt
– Tidsbesparande
– Økonomisk
– Kompetanseavhengig
• Gjenkjenning av
mønster;
”laboratorielegekunst”?
The United Kingdom National External Quality
Assessment Scheme (Blood Transfusion Laboratory
Practice): trends in proficiency and practice between
1985 and 2000
S. M. Knowles*, C. E. Milkins*, J. F. Chapman† and M. Scott‡
Transfusion Medicine
Volume 12 Page 11 - February 2002
The United Kingdom National External Quality
Assessment Scheme (Blood Transfusion Laboratory
Practice): trends in proficiency and practice between
1985 and 2000
S. M. Knowles*, C. E. Milkins*, J. F. Chapman† and M. Scott‡
Transfusion Medicine
Volume 12 Page 11 - February 2002
Agglutinasjonsteknikkar – fordeler
og ulemper
• velprøvd, innarbeida
• stor teknisk og medisinsk
kompetanse opparbeidd
• klinisk intuitive metodar
• verifiserande forlik
• enkelt utstyr, kan utførast ”kvar
som helst”
• ”low tech”, relativt manuelle
metodar
• subjektive, operatøravhengige
• fleirtrinnsprosess, indirekte
testresultat
• semikvantitative
• automatiserte einingar ueigna
for andre
transfusjonsmedisinske testar
• ressurskrevjande
–
–
–
–
levande celler
testcellegivarar
tidkrevjande
kostbart
Flowcytometrisk blodtyping
Transfusion
Volume 43 Page 918 - July 2003
Molekylærbiologiske teknikkar
• Molekylær basis for
blodtypeantigen/
fenotypar
– SNP
– Exonduplikasjon
– Delesjon av gen, exon,
nukleotid
– Innsetjing av
nukleotid(er)
• Metodikk
– Konvensjonell/realtime PCR
– RFLP
– Allelspesifikk/
sekvensspesifikk PCR
– Enkel/multiplex PCR
– DNA microarrays
Proteomikk
”Goodbye to
agglutination and all
that?”
David J. Anstee
Transfusion
Volume 45 Page 652 - May
2005