Transcript gene engineering

基因工程
•
•
•
•
•
•
•
基因工程 （gene engineering）
重组DNA技术 （recombinant DNA technique）
分子克隆（molecular cloning）
基因操作（gene manipulation）
遗传工程 （genetic engineering）
基因克隆（gene cloning）
遗传操作（genetic manipulation）
制备外源DNA
EcoRI酶切
EcoRI酶切
连接
转化
细胞分裂、
筛选
基因克隆的工具酶
限制性内切酶
Restriction endonuclease
type II
93%
II型酶限制修饰系统分别由限制酶和
修饰酶两种不同的酶组成。
II型酶需Mg2+作为催化的辅助因子，
相应的修饰酶需 SAM
识别序列主要为4-6bp，识别回文对称序
列，在回文序列内部或附近切割
识别序列
① 回文对称
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
HindIII
AAGCTT
TTCGAA
②多识别序列
AccI
(简并序列)
GTMKAC
HindII GTYRAC
R=A or G
K=G or T
M=A or C
Y=C or T
③间断对称
AlwNI
CAGNNNCTG
DdeI
CTNAG
切割位置
① 内部
大多数
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
HindIII
AAGCTT
TTCGAA
② 两端
EcoRII
CCWGG
Sau3AI
GATC
NlaIII
CATG
③ 两侧
BcgI
(10/12)CGA(N)6TGC(12/10)
10(N)CGA(N)6TGC(N)12
12(N)GCT(N)6 ACG(N)10
限制性内切酶产生的末端
1. 匹配粘端(粘性末端）
Cohesive terminus (end)
① 在对称轴5’侧切割底物
DNA双链交错断开→5’protruding
EcoRI
…NNG
…NNCTTAA
…NNGAATTCNN…
…NNCTTAAGNN…
AATTCNN…
GNN…
② 3’-侧→3’突出末端
5‘ recessed
KpnI
..NNGGTAC
..NNC
GGTACC
CCATGG
CNN..
CATGGNN..
2.平端
Blunt end
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV
GAT↓ATC
XmnI GAANN↓NNTTC
3.同裂酶(isoschizomer)
识别相同序列的限制酶称同裂酶
HindII HincII
MobI
Sau3AI
GTY/RAC
/GATC
4.同尾酶
BamHI GGATCC
Sau3AI
GATC
EcoRI
MfeI
ApoI
GAATTC
CAATTG
RAATTY
BstBI TTCGAA
TaqI
TCGA
SpeI
NheI
XbaI
StyI
ACTAGT
GCTAGC
TCTAGA
CCWWGG
New England Biolabs NEB
TAKARA BIO INC.
Takara
末端长度对切割的影响
2hr 20hr
HindIII
EcoRI
CAAGCTTG
CCAAGCTTGG
CCCAAGCTTGGG
GGAATTCC
0
0
0
0
10% 75%
>90
>90
PstI
GCTGCAGC
TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAG(N) 14
CTGCAG(N) 20
2hr 20hr
0
0
10 10
>90 >90
0
0
 在设计引物引入酶切位点时,
应在位点之外引入所要求的碱基
数。
双酶切策略
a. 选用都合适的Buffer
b. 不可替代：先低，加适量NaCl
和第二种酶
c. 先低后高（可纯化或不纯化）
EcoRI
5’…GAATTC…3’
3’…CTTAAG…5’
ClaI
甲基化酶 Methylase
methyltransferase
Methylation
一、甲基化酶的种类
在真核和原核生物中存在大量的
甲基化酶，
在E.coli中大多数都有三个
位点特异性的DNA甲基化酶
1.
Dam甲基化酶
GATC
腺嘌呤N6位置 引入甲基
 PvuII
BamHI BclI BglII XhoII
MboI Sau3AI
识别位点中含GATC序列
 ClaI(1/4)
XbaI (1/16) TaqI (1/16)
MboII (1/16) HphI(1/16)
部分识别序列含GATC序列
4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列
HapI ClaI linker
Oypl-1 5’ GTTACCAGTTAACGCAAGCTTCGATCGATCG-3’
Oypl-2
3’GTCAATTGCGTTCGAAGCTAGCTAGCCAATG-5’
HpaI
HindIII
ClaI
2.
Dcm甲基化酶
识别CCAGG或CCTGG序列
在第二个C上C5位置上引入甲基
EcoRII
CCA(T)GG
EcoRII受dcm甲基化作用影响
大肠杆菌DNA聚合酶 I Ecoli DNA polymerase I
Klenow酶 Klenow fragment
反转录酶 Reverse transcriptase
末端转移酶 Terminal transferase
T4 DNA连接酶 T4 DNA ligase
碱性磷酸酶 Alkaline phosphatase
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
Ecoli DNA polymerase I
1. 活性
单链多肽(109kDa)
三种活性
① 5’→3’DNA聚合酶活性
底物: 模板(ssDNA), 引物（带3‘OH基）
或 5’突出DsDNA
Mg2+ dNTP
DNApolyI
②5’→3’外切核酸酶活性
底物: dsDNA or DNA: RNA杂交体
活性：从5’端降解dsDNA，也降解
RNA:DNA中的RNA(RNase H 活性)
Mg2+
DNApolyI
③3’→5’外切酶活性
底物：3’-OH dsDNA or ssDNA
活性：从3’-OH端降解DNA，可被5’→3’聚合
活性封闭。
Mg2+
DNApolyI
2.
用途
切口平移法标记DNA
Nick translation
（所有DNApoly中只有此有此活性）
Mg2+,
低限量DNase
I
产生切口
dNTP
DNApoly I
切口平移外切活
性和合成活性共同
作用使切口沿5’--3’
方向平移
若有放射性dNTP, 则可标记成探针
二、Klenow酶
E.coli DNA polymerase I large fragment
Klenow fragment
在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解, 从全酶
中除去5’—3’外切活性片段，而聚合活性和
3’—5’外切活性不受影响.
76kDa
1. 活性
共两种, 同 DNApoly I
2.作用
① 补平3’凹端，注意要用 dNTP
② 末端标记:补平3’--凹端的过程进行标记
③ cDNA克隆中合成第二链
④ 随机引物标记
⑤ 在体外诱变中，用于从单链模板合成dsDNA
三、反转录酶
Reverse transcriptase
依赖于RNA的DNA聚合酶
5’ →3’合成DNA
无3’ →5’外切活性
1．种类
来自AMV禽成髓细胞瘤病毒
Mo-MLV(M-MuLV)
Moloney鼠白血病病毒
AMV
二链多肽(62kDa/94kDa)
具5’→3’DNA聚合活性
具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA)
42℃反应
M-MuLV
单肽 84kDa RNase H 活性弱
利于合成较长cDNA
37℃反应
纯度高 工程产品
ProtoScript® AMV First Strand cDNA Synthesis Kit
37-50℃
四、末端转移酶
Terminal transferase
来源于小牛胸腺,存在于前淋巴细胞及分化早
期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNApoly
T, C →首选 Co2+
A, G→首选Mg2+
在二价阳离子存在下，末端转移酶催化
dNTP加于DNA分子的3’羟基端
1. 底物
DNA, 可短至3个核苷酸, 3’突出
低离子强度时,平端或3’凹出端DNA亦可
但效率低
2. 用途
① 在3’端加同聚尾，cDNA或载体，用于
克隆，或标记
② 末端标记 ddNTP(标记的)
3. 同尾的长度
pmol 3’-OH:
M dNTP
dA
dC
dG
dT
1:0.1
1～10
1～5
1～5
1～10
1:1.5
10～30
10～30
10～20
10～35
1:3.0
100～200
100～200
15～35
200～250
1:15
400～500
400～500
15～35
300～400
五、T4 DNA ligase
68kDa T4噬菌体感染大肠杆菌产生
催化DNA 5’磷酸基与3’羟基之间
形成磷酸二脂键
条件
16℃
4℃
需ATP
～4hr
overnight
5min 连接 T4 DNA ligase
Room temperature
(Boehringer Meinnham 公司)
基因工程的载体
载体(vector)
 目的基因进入原核或真核细胞并高效复制
和表达蛋白质，需要装入载体才能实现。
 作为基因工程载体所需具备的基本条件：
1.能自我复制，并具一定的拷贝数。
2.带有抗性基因，便于筛选和鉴定。
3.在适当的位置有单酶切位点，便于重组操作。
4.带有强启动子，驱动目的基因在宿主细胞
内高效表达。
基因工程载体的种类和用途：
1.细菌质粒：最常用的用于目的基因克隆或表达的
载体。
2.
3.
4.
5.
6.
酵母质粒：用于在酵母中表达目的蛋白。
噬菌体：主要用于构建基因组DNA或cDNA文库
粘粒：用于克隆大片段DNA。
M13噬菌体 专用于Sanger双脱氧DNA测序
病毒：包括人或哺乳动物病毒、昆虫病毒及植物
病毒。用于在真核细胞中表达目的蛋白。
克隆载体
• 外源基因不表达
• 早期使用的克隆载体的典型代表
–pBR322，目前已较少使用，多被用作
构建新克隆载体的起始材料
–pUC 由pBR322的氨苄青霉素抗性基因
和复制子与大肠杆菌-半乳糖苷酶
（lacZ）基因融合而成
表达载体
• 含有强启动子的载体
• 外源基因可在启动子的控制下转录成mRNA，
并最终以蛋白质的形式在宿主细胞中表达
• 真核表达载体的启动子（动物）
• 人巨细胞病毒（CMV）基因启动子的pcDNA 系列真
核表达载体.
• 空泡病毒SV40 基因启动子的pSV系列真核表达载
体.
• 单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus I）（HSV1 α）基因启动子
的真核表达载体phIE。
• 人类α-actin启动子真核表达载体。
• 人端粒酶催化亚单位(hTERT)的启动子的真核表达载体pEGFP-hTERT
酵母表达载体的启动子
 巴斯得毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统,
它所具有的醇氧化酶(甲醇代谢的关键酶)基因-
1(AOX1)的启动子是一种强有力的启动子，受甲
醇严格诱导调控而表达.
 组成型表达的甘油醛一3一磷酸脱氢酶（GAP）
的启动子
常见的大肠杆菌表达系统
①T7表达系统T7噬菌RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动
子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5
倍。组成型启动子 。
②Lac表达系统是β-半乳糖苷酶编码基因LacZ的转录的调控
序列，该启动子可以被IPTG诱导，所以在培养基中加入该
安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。
③Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，
其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导表达。
④λPL表达系统是负责λDNA分子转录的启动子之一，是一种
极强的诱导型启动子。
报告载体
• 一种易于用生化方法检测的基因作为报告
基因，通过其表达强度的高低来研究外源
调控因子（如启动子、增强子等）的功能
• 通常由p-Basic、p-Enhancer、pPromoter、p-Control组成
常用的报告基因
• pGL2 ：萤火虫荧光素酶
luciferase，luc
• pCAT ：氯霉素乙酰转移酶
chloramphenicol
acetyltransferase，cat
• pSEAP：分泌型人胎盘碱性磷酸酶
human placental alkaline
phosphatase，seap
•荧光素酶基因的检测
用作报告基因的荧光素酶主要来自萤火虫。
萤火虫荧光素酶催化的底物是6-羟基喹啉类，在Mg2+、
ATP及O2作用下，酶使底物氧化脱羧，生成激活态的氧化荧光
素，其发射光子后转变成常态的氧化荧光素，反应中化学能转
变成光能。
萤火虫荧光素酶
荧光素＋ATP+ O2
氧化荧光素＋CO2+AMP+PPi+光
firefly luciferase萤火虫荧光素酶
renilla-luciferase海肾荧光素酶
•cat（氯霉素乙酰转移酶）基因的检测
氯霉素最早是从放线菌属委内瑞拉链霉菌中分离出来的，现在使
用的是化学合成品。氯霉素能选择地与原核细胞50S亚基或真核细胞线
粒体核糖体大亚基结合，抑制蛋白质合成。
cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，该酶催化酰基由乙酰CoA
转向氯霉素，而乙酰化的氯霉素不再具有氯霉素的活性，失去
了干扰蛋白质合成的作用。真核细胞不含氯霉素乙酰转移酶基
因，无该酶的内源性活性，因而cat基因可作为真核细胞转化
的标记基因及报告基因。cat基因转化的植物细胞能够产生对
氯霉素的抗性，并可通过对转化细胞中氯霉素乙酰转移酶活性
的检测来了解外源基因的表达。
cat的活性可以通过反应底物乙酰CoA的减少或反应产物乙
酰化氯霉素及还原型CoASH的生成来测定，目前常用的方法有
硅胶G薄层层析法及DTNB分光光度法。
Assay of CAT Activity
The most rapid, sensitive, and convenient of these is based
on liquid scintillation counting (LSC) of CAT reaction products. Cell extracts are
incubated in a reaction mix containing 14C- or 3H-labeled chloramphenicol and
n-Butyryl Coenzyme A. CAT transfers the n-butyryl moiety of the cofactor to
chloramphenicol. For the LSC assay, the reaction products are extracted with a
small volume of xylene. The n-butyryl chloramphenicol partitions mainly into the
xylene phase, while unmodified chloramphenicol remains predominantly in the
aqueous phase (19). The xylene phase is mixed with scintillant and counted in a
scintillation counter. This assay can be completed in as little as 2–3 hours, is linear
for nearly three orders of magnitude and can detect as little as 3 × 10–4 units of
CAT. CAT activity can also be analyzed using thin layer chromatography (TLC).
This method is more time-consuming than LSC but allows visual confirmation of
the data. For more information, see the CAT Enzyme Assay System with Reporter
Lysis Buffer Technical Bulletin #TB084 (available at www.promega.com/tbs/).
一. 质粒载体
• 2-200kb
• 发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母
• 独立于染色体之外进行复制和遗传,
又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来
进行复制和转录。
• 比病毒还简单的亚细胞结构，一旦
离开寄主细胞则无法繁殖。
结构特性
DNA结构和物理学特征：质粒与染色体不同
a.
b.
c.
d.
离心: 密度不同
agarose电泳: 分子量大小
电镜观察: 1μm dsDNA=3000bp
再转化
质粒载体的设计
• 抗生素
• 蓝白斑筛选
• 多克隆位点
• 表达载体
构建质粒载体
(1)分子量尽量小。＞15kb•时转化效率低。
小质粒优点:①容易提取；
②较为抵抗机械(超声波)切割；
③多拷贝，给克隆基因提供了剂量效应；
④对内切酶提供多切点的机会大为减少。
(2)了解载体上基因位置/限制酶作用位点。
(3)包含可供选择的标记性状(基因)
(4)最大限度地具有限制酶的单切点
1. pBR322 has an origin of replication,
ori. This sequence is required to
propagate the plasmid and maintain it at
a level of 10 to 20 copies per cell.
2. The plasmid contains two genes that
confer resistance to different antibiotics
(tetR, ampR).
3. Several unique recognition sequences
in pBR322 (PstI, EcoRI, BamHI, SalI,
PvuII) are targets for different restriction
endonucleases, providing sites where the
plasmid can later be cut to insert foreign
DNA.
4. The small size of the plasmid (4,361
bp) facilitates its entry into cells and the
biochemical manipulation of the DNA.
• pBR 322
4361 bp
Ampr
Tetr
pUC18/19
穿梭质粒载体
shuttle plasmid vector
是指一类由人工构建的具有两种不同
复制起点和选择标记，因而可在两种不同的
寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这
类质粒载体可以携带外源DNA序列在不同物种
的细胞间，特别是在原核和真核细胞之间往
返穿梭，因此在基因工程的研究中是十分有
用的。
Plasmids pEMBLY: new single-stranded shuttle vectors for the
recovery and analysis of yeast DNA sequences
Abstract
We describe the construction and properties of pEMBLY plasmids. They
belong to a new family of yeast shuttle vectors which are derived from
plasmid vector pEMBL9 and offer the following improvement: (i) relatively
small size; (ii) large number of cloning sites; (iii) screening for insertcontaining plasmids on indicator plates; (iv) different combinations of genes
which complement auxotrophic deficiencies and sequences that support DNA
replication in Saccharomyces cerevisiae; and (v) ability to isolate the plasmid
DNA in single-stranded (ss) form. The yeast S. cerevisiae can be efficiently
transformed by these plasmids in both the ss and double-stranded (ds) forms.
Finally, the presence of the phage f1 intergenic region allows one to obtain the
cloned sequences in the ss form upon infection with the wild-type ss phage
质粒载体多种用途
转录、测序、亚克隆、表达
转化E.coli容易，重复性高
容易大量分离提纯
质粒载体筛选方法
插入失活
α－互补：IPTG,X-GAL
直接筛选：抗生素
表达筛选（抗体筛选）
Probe筛选
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 IPTG
质粒载体缺点
ＣaCl2转化效率低
克隆片段小于１０kb
二 噬菌体(phage)克隆载体
1.
噬菌体(phage)
2.
粘粒(cosmid)
3.
M13噬菌体
1
λ噬菌体克隆载体
λ 噬菌体的生物学特性：
λ 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体
λ 噬菌体由外壳包装蛋白和λ-DNA组成
λ-DNA全长48502个核苷酸
λ-DNA上至少有61个基因
cos位点（cohesive end site):
在DNA两端各有12nt的5`单链突出，彼此
序列互补。它是包装时的切割信号。
λ 噬菌体生物学特性： 溶原状态
λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其
DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬
菌体颗粒，这种情况为溶原状态。
整合主要由λ-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而
这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。
人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌
体或处于溶原状态，或处于溶菌状态.
DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态
λ-DNA载体的构建：缩短长度
野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，
只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装
成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长
度，可以提高装载量。其实野生型λ-DNA上约有40-50%
的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可
将λ-DNA分成两大类载体：

插入型载体

取代型载体
λ-DNA载体的构建：
构建琥珀密码子的突变体
琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突
变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码
产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。
将野生型λ-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG
密码子突变成UAG。当这种λ-DNA进入一般的大肠杆菌菌
株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂
解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，
而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正
功能的菌株
λ-DNA载体的主要类型：
插入灭活型载体: Charon2、Charon6、λgt11
取代型载体λ: EMBL4、λgtλc、λNM762、Charon40
正选择型载体:λEMBL1、λL47、λ1059
野生型的λ噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖
（Spi+）， 这种生长抑制表型受λ-DNA上的red和gam两个
基因控制。若将外源DNA取代red和gam ，重组噬菌体便拥
有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁
殖，并形成透明斑
λ-DNA重组分子的体外包装：
λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组
颗粒，方可高效导入受体细胞
用于体外包装的蛋白质可直接从感染了λ噬菌体的大肠杆菌
中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两
部分：
一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当这两
部分包装蛋白与重组λ-DNA分子混合后，包装才能有效进行，
任何一种蛋白包装液被重组λ-DNA污染后，均不能被包装成
有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的
用途：
a.用作一般的克隆载体。
b.用于构建基因组或cDNA文库。
c.用于抗体库或随机肽库的构建。
粘粒(cosmid)
考斯质粒载体的构建：
考斯质粒是一类人工构建的含有
λ-DNA cos序列和质粒复制子的
特殊类型的载体
1978年Collins和Hohn发明构建
1.8 kb的λ-DNA片段+ pBR322片
段装载范围为31 - 45 kb
组成：
1. 质粒复制的起始位点(ORI)；
2. 抗性基因；
3. 用于插入目的基因的单个酶切位点；
4. 噬菌体的cos位点。
可见，cosmid是由质粒和噬菌体的
cos位点构建而成。
特点：
1.可插入长达27～41kb的外源基因，
方便地用于克隆大片段DNA。
2.加入噬菌体头部和尾部蛋白，可将
粘粒包装成类似于噬菌体的具感
染能力的颗粒，方便地进入大肠杆菌
。
3.粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体
的功能，而表现质粒的特性。
3
大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA
M13噬菌体的生物学特性： 生物结构
 M13噬菌体的外型呈丝状
 M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA
组成
 M13 DNA全长6407个核苷酸
 M13 DNA上至少有10个基因
2700个外壳蛋白分子
M13噬菌体几个重要特点：
1.
M13噬菌体不裂解宿主细胞，只是降
低宿主细胞的生长速度。
2. M13噬菌体能以单链和双链两种方
式存在，因此可以用感染(经包装的
单链DNA)和转化(双链DNA)。
3. 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，
只有1.5 kb
M13噬菌体用途：
1.
DNA序列测定；
2.
制备单链DNA探针；
3.
用于定点突变的研究。
噬菌粒（phagemid or phasmid）
噬菌粒载体的特点：
噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复
制子、以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类
型的载体





能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞
装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）
能像质粒那样在受体细胞中自主复制
重组操作简便，筛选容易
通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA
pBC KS +/-
KS represents the orientation of the MCS in which lacZ transcription proceeds
from KpnI to SacI.
(+) and (-) symbols on pBluescript II phagemids indicate the orientation of the
cloned phage f1 intergenic (IG) region carrying the sequences required in cis for
initiation and termination of phage f1 DNA synthesis and for packaging of DNA
into bacteriophage particles.
pBluescript II phagemids are designed for DNA cloning,
dideoxy DNA sequencing, in vitro mutagenesis and in vitro
transcription in a single system.
pBluescript II KS(-), pBluescript II KS(+)
pBluescript II SK(-), pBluescript II SK(+)
pBK-CMV
五 动物表达载体
Animal Gene Delivery Principles
AAV
Nucleus
Functional
changes
Adenovirus
Retrovirus/Lentivirus
Naked DNA
Target
Cell
Protein
expression
Non-Viral Methods of Transgene Delivery
Advantages
Easy to produce transgene particle
Non-immunogenic
Disadvantages
Inefficient cell entry
Inefficient nuclear entry
Transient transgene expression
Adeno-associated virus (AAV)
Advantages:
• Highly efficient transduction for both replicating
and non-replicating cells
• Infect almost only neuron in brain
• Good long term expression
• Normally no human pathogenicity
Disadvantages:
•Only 5% integration—diluted when cells divide
•Complicated purification process
Adenovirus
Advantages:
•
Highly efficient transduction of replicating and nonreplicating cells. Good for neurons
• High titer production readily achievable
• Normally - minimal human pathogenicity
Disadvantages:
•
No integration—diluted when cells divide
逆转录病毒载体
• 逆转录病毒是一类含RNA的病毒，进入受
体细胞后，RNA反转录成DNA，通过两端
由数百bp组成的长末端重复序列，整合
到染色体上，成为原病毒。
• 只要将外源目的基因组入原病毒DNA的合
适克隆位点，就能在感染的动物细胞中
表达。
Retrovirus
Advantages:
•
•
Highly efficient transduction of replicating cells (
Highly efficient transduction of non-replicating cells
(FIV, HIV…). Good for neurons
• Integrate into genome of target cells for long-term
expression in dividing cells.
• Easy to produce
• High titer production readily achievable
Disadvantages:
•
Possible human pathogenicity
Retrovirus
目前常用的逆转录病毒载体是经过改造
的Moliney鼠白血病病毒（MoMLV）。
基因结构分子两端含长末端重复序列
（其中含启动、增强子及病毒整合到宿主
基因组中所需的序列）。
结构基因主要编码核壳蛋白（gag）、逆
转录酶（pol）和外壳糖蛋白（env）。
5‘端LTR与 gag 间还有一段包装信号
序列 (psi, φ )。
Psi 的功能是介导两个基因组RNA的
聚合，然后与 gag编码的锌指蛋白结合，
包装成成熟的二倍体病毒颗粒。
LTR
psi
gag
pol
env
LTR
逆转录病毒基因组的结构
LTR: 长末端重复序列； gag:核壳蛋
白基因；pol:逆转录酶基因；env:外
壳糖蛋白基因；psi: 包装信号序列
逆转录病毒的长末端重复序列位于(LTR) 逆
转录病毒基因组两端,结构为U3-R-U5 的顺
向重复序列单位。主要包括四个功能域:
远距离调节单位;
增强子单位;
核心启动子单位;
Tat反应元件
逆转录病毒载体的构建
先构建前病毒DNA的载体，包括两端LTR和包装
序列，除去结构基因，插入标记基因，细菌复制
子和多克隆位点。
保留逆转录病毒的基因调控序列，利于外源基因
的整合和表达。除去致病的结构基因。往往还插
入受控于LTR的外源启动子（如SV40和CMV等，
位置多位于目的基因和标记基因之间。
重组逆转录病毒载体由于缺乏结构基
因，不能包装完整的有感染能力的病毒颗
粒。因此，需要将其导入整合有辅助病毒
的包装细胞，才能完成生活周期。
辅助病毒也是经过改造的MoMLV， 它的
结构基因完整，但包装信号序列缺损。
辅助病毒在包装细胞中可表达病毒的全部
基因产物，但由于缺psi，不能装配完整的
颗粒，因此，只能存于靶细胞中，不能扩
散。
Onco-retroviral expression system
Expression Plasmid
LTR

CMV
Transgene X
LTR
GAG
POL
PolyA
Packaging Plasmid
CMV
Envelope Plasmid
CMV
VSV-G
PolyA
No Accessory Genes - ie. vpu, vpr, nef
Lentivirus/HIV Genome
病毒基因组全长约9200bp，其5’端和3’端各有一段相同
的核苷酸序列，是长末端重复序列(LTR)，中间含有env 、
pol、gag 3个结构基因和tat、rev、nef、vif、vpu、vpr等
6个调节基因。
结构基因
env基因：编码gp41：介导病毒包膜与宿主胞膜的融合；
gp120：有病毒颗粒与NT抗体及宿主细胞表面
的CD4分子结合的部位。
pol基因：编码产生逆转录酶(p66/p53)和整合酶(p31)，与
病毒的复制有关。
gag基因：编码产生蛋白前体，经酶解后形成3种蛋白(P17、
P24、P15)。
调节基因： tat、rev、nef、vif、vpu、vpr
tat、rev和nef的产物对HIV表达的正、负调节以及对维持
HIV在细胞中复制平衡和控制HIV潜伏有重要意义。
长末端重复序列(LTR)：对病毒转录的调控起关键作用。
Lentivirus capsid
HIV-1 Life Cycle
1. Adsorption
12. Budding
2. Fusion
11. Assembly
and
packaging
3. Uncoating
10. Translation
4. Reverse
transcription
5. Nuclear
entry
9. Nuclear export
8. Splicing
7. Transcription
CYTOPLASM
6. Integration
NUCLEUS
Lentiviral gene expression system
cPPT
GA
U3 deletion
RRE
WPRE
CMV MeCP2

LTR
SD
CMV
U3 deletion
LTR
Self-Inactivating
Transfer Vector
SA
GAG

PRO
RSV
POL
RRE polyA
Packaging
Constructs
REV polyA
CMV VSV.G
polyA
Envelope
HIV-1 Life Cycle
1. Adsorption
12. Budding
2. Fusion
11. Assembly
and
packaging
3. Uncoating
10. Translation
4. Reverse
transcription
5. Nuclear
entry
9. Nuclear export
7. Transcription of
transgene
8. Splicing
7. Transcription
CYTOPLASM
6. Integration
NUCLEUS
Making lentivirus using cultured cells
Make
lentivector
Purify large
quantity high
quality DNA
Titier virus
Concentrate virus by
ultracentrifugation
Transfect into
293T cells
Collect culture
medium
containing virus
RNAi delivered by Lentiviral System
cPPT
GA
RRE
U6

LTR
SD
WPRE
siRNA
CMV EGFP
Self-Inactivating
Lenti Vector
LTR
SA
GFP
siRNA
siRNA Expression Vectors
表达载体
原核表达载体： 适用于在原核细胞中表
达外源基因的载体。
• 主要元件：强启动子
SD顺序
筛选标志
其它调控基因
The order of the major features in this plasmid is:ori(f1) - lacZ T7 promoter - MCS (KpnI-SacI) - T3 promoter - lacI - ori(pMB1)
- ampR - ori (2 micron) - URA3. Contains the REP3 and FRT
sequences necessary for high copy propagation in yeast. In S.
cerevisiae, the copy number is about 20 per haploid cell. In nonselective growth, plasmids are lost through mitotic segregation at
rates in the range of 4.4 + or - 1.4% of progeny per doubling.
YE-type shuttle vector encoding the beta-galactosidase alpha
peptide, permitting blue-white visual detection. Can be used to
produce ssDNA. Contains promoters for in vitro RNA synthesis
and priming sites useful for sequencing. Restriction digests of
the clone give the following sizes (kb): BamHI--5.8; EcoRI--5.8;
PstI--4.0, 1.7; PvuII--5.2, 0.54. (ATCC staff) Medium is 1227
LB plus ampicillin. NCBI gi: 416322 Hosts: E.coli DH5alpha,
Saccharomyces cerevisiae, E.coli. Related vectors: pRS424,
pRS425, pRS423.
Size (kb): 5.726
Vector: pRS426
(phagemid)
Promoters: Promoter T7
(phi10)
Construction: pJS92,
pRS306, pBluescript II
SK+
Marker(s):URA3,ampR
Construct size (kb): 5.726
Features: insert detection:
lacZ'
marker(s): URA3
marker(s): ampR
promoter: T3
promoter: T7 (phi10)
promoter: lac
replicon: 2 micron
replicon: f1
replicon: pMB1
MCS: KpnI...SacI
T7 promoter: bases 864-882
Polylinker: bases 889-994
Sp6 promoter: bases 999-1016
BGH poly A: bases 1018-1249
SV40 promoter: bases 1790-2115
SV40 origin of replication: bases
1984-2069
Neomycin ORF: bases 2151-2945
SV40 poly A: bases 3000-3372
ColE1 origin: bases 3632-4305
Ampicillin ORF: bases 4450-5310
Comments for pcDNA3.1 (+)
5428 nucleotides
CMV promoter: bases 232-819
T7 promoter/priming site: bases 863-882
Multiple cloning site: bases 895-1010
pcDNA3.1/BGH reverse priming site:
bases 1022-1039
BGH polyadenylation sequence: bases
1028-1252
f1 origin: bases 1298-1726
SV40 early promoter and origin: bases
1731-2074
Neomycin resistance gene (ORF): bases
2136-2930
SV40 early polyadenylation signal:
bases 3104-3234
pUC origin: bases 3617-4287
(complementary strand)
Ampicillin resistance gene (bla): bases
4432-5428 (complementary strand)
ORF: bases 4432-5292 (complementary
strand)
Ribosome binding site: bases 5300-5304
(complementary strand)
bla promoter (P3): bases 5327-5333
(complementary strand)
• 类型：
融合型表达载体：----融合蛋白
非融合型表达载体：---天然完整蛋白
分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌
至胞周间隙
（一）融合型表达载体
Foreign DNA
P
SD
融合型表达载体
融合基因
技术关键：克隆基因插入原核序列3’端
而维持正确阅读框架。
• 选择合适酶切位点
• 加人工合成的DNA接头
• 构建位相载体
载体部分序列
EcoRI
----ATG ---- AAC CTG GAA TTC CTA GGT ------TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT
TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
位相载体----含有3种读码框的系列载体
优点：
• 表达效率高
• 产物稳定
• 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
鉴定
• 易纯化：利用融合原核多肽的特性
融合型载体----pGEX系列
Ptac：IPTG诱导
GST融合蛋白—直接纯化
产物切割方便：
位相载体
（二）非融合型表达载体
Foreign DNA
P
SD
非融合型表达载体
非融合基因
主要元件：强启动子
SD：
ATG：第一个密码子
非融合型表达载体----pPL-Lamda
PL启动子---温度
诱导
插入位点--HpaI
（三）分泌型表达载体：
1、主要元件：
启动子和SD序列
信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽，
可引导蛋白跨膜
2、优点：分泌表达，避免降解。
分泌型表达载体----pINIII-ompA1
分泌型融合表达载体----pEZZ18