Transcript 第二章 基因工程的酶学基础 Enzymes 1

第二章
基因工程的酶学基础
Enzymes
1
本章节内容
第一节 限制性核酸内切酶
第二节 DNA连接酶
第三节 DNA聚合酶
第四节 DNA修饰酶
第五节 核酸外切酶
第六节 单链核酸内切酶
2
本章学习内容
重点讨论限制性核酸内切酶和DNA连接酶在
DNA切割和连接中的应用，并简要介绍其他
与基因克隆有关的其它的重要的酶。
3
第一节
限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶
（Restriction endonuclease）
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特
定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的
核酸内切酶。
4
1. 来源
2. 性质
主要来源于原核生物
内切酶
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。
形成5’-P和3’-OH末端
3. 功能
自我保护作用
细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
5
6
（1）限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA
进行分解，切成小片断。
7
（2）修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所
保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
① Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase)
GATC
腺嘌呤N6位置引入甲基
② Dcm甲基化酶(DNA
cytosine Methylase)
CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上
引入甲基
8
9
（3）限制与修饰系统相关的三个基因
① hsd R: 编码限制性内切酶
这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双
链DNA切断
② hsd M: 编码限制性甲基化酶
这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，
即起修饰 DNA的作用。
③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达
作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。
10
二、限制性内切酶的命名
1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，
命名原则如下：
1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3
个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基
本名称。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；
流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
11
2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株
名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因
位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母
表示此染色体外遗传成分。
如
Hind Ⅱ：d菌株
EcoR I ：抗药性R质粒
12
3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修
复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的
先后次序。
如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶
4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名
称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。
如 R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶
M.Hind Ⅲ 表示相应的甲基化酶
实际应用中，R常被省略。
13
三、限制性内切酶的类型
目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。主要的
三种：
Ⅰ 型限制性内切酶
Ⅱ 型限制性内切酶
Ⅲ 型限制性内切酶
14
1. Ⅰ型限制性内切酶的基本特性
首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌
B株和 K株分离的。
如 EcoB和 EcoK。
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的特异序列。
EcoB： TGA(N)8TGCT
EcoK：AAC(N)6GTGC
15
（2）切割位点
在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随
机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大
Recognize site
cut
1-1.5kb
（3）辅助因子
需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）
16
2. Ⅱ类限制性内切酶的基本特性
首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从
流感嗜血菌中分离出来。
分离的第一个酶是Hind Ⅱ
基因工程用途最大
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数
是呈典型的旋转对称型的回文结构）。
与DNA的来源无关，即没有种的特异性。
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稀有切割限制酶（rare cutter）
可以识别6个以上的核苷酸序列的少
数的限制内切酶。
如Not I （GCGGCCGC）
某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个
碱基并非严格专一。
如Hind Ⅱ可识别4种核苷酸序列：
5’Y: C或T
GTYRAC
-3’
R: A 或G
18
（2）切割位点
识别位点处
切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或
平齐末端（blunt end）。如：
EcoR I 5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
Pst I
5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC-5’
EcoR V
5’-GATATC-3’
3’-CTATAG-5’
产生平齐末端
产生粘性末端
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[1] 粘性末端（sticky ends，cohensive ends）
含有几个核苷酸单链的末端。
分两种类型：
ⅰ） 5’端凸出（如EcoR I切点）
5’3’5’3’-
-3’
-5’
GAATTC
CTTAAG
G
CTTAA
AATTC
G
-3’
-5’
20
ⅱ） 3’端凸出（如Pst I切点）
5’3’-
5’3’-
CTGCAG
GACGTC
CTGCA
G
G
ACGTC
-3’
-5’
-3’
-5’
21
[2] 粘性末端的意义
① 连接便利
i）不同的DNA双链：
只要粘性末端碱基互补就可以连接。
这比连接两个平齐末端容易得多。
ii）同一个DNA分子内连接：
通过两个相同的粘性末端可以连接成环
形分子。
22
23
② 末端标记
A 末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。
B 末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸
的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘
性末端。
③ 补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
24
[3] 平齐末端（blunt end）
在识别序列的对称轴上同时切割
如EcoR V
5’-
GATATC
-3’
3’-
CTATAG
-5’
25
[4] 平齐末端的特点
连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接
效率的1%，这种连接常出现多联体连接。
粘性末端与平齐末端连接的处理方法
ⅰ）添补法：
利用DNA聚合酶Ⅰ (klenow fragment）将碱基添
补到目的基因的粘性末端上。
26
ⅱ）削除(平)法
利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末
端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端
27
[5] 同裂酶（Isoschizomer)
不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式
相同或不同。
① 完全同裂酶：
识别位点和切点完全相同
如Hind Ⅲ 和Hsu I
Hind Ⅲ
5’-AAGCTT-3’
3’-TTCGAA-5’
Hsu I
5’-AAGCTT-3’
3’-TTCGAA-5’
28
② 不完全同裂酶：
识别位点相同，但切点不同。
如Xma I 和 Sma I。
Xma I
5’-CCCGGG -3’
3’-GGGCCC-5’
Sma I
5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5’
29
[6] 同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如
BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等
BamH I
5’-GGATCC-3’
3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ
5’-AGATCT-3’
3’-TCTAGA-5’
Bcl I
5’-TGATCA-3’
3’-ACTAGT-5’
Xho Ⅱ
5’-UGATCY-3’
3’-YCTAGU-5’
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
30
Sau 3A
5’-GATC----3’
3’----CTAG-5’
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点
一般不能再被原来的酶识别。
BamH I 5’-G
3’-CCTAG
BamH I
GATCT-3’
A-5’
5’-GGATCT-3’
3’-CCTAGA-5’
Bgl Ⅱ
Bgl Ⅱ
Sau 3A
31
[7] 限制酶的酶活性
限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的
温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割
能力和位点的专一性。
所以一般使用专一的反应缓冲液。
① 星号（*）活性
如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割
效率，称为星号（*）活性。
32
使用的时候要特别注意！
EcoR I和BamH I等都有*活性。
EcoR I： GAATTC
在低盐、高pH（>8）时可识别和切割
GAATTA、AAATTC、GAGTTC等
7
33
② 诱发星号（*）活性的原因
ⅰ）高甘油含量
ⅱ）内切酶用量过大
ⅲ）低离子强度
ⅳ）高pH
ⅴ）含有机溶剂，如乙醇
ⅵ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二价阳离子的存在
酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件
34
[8]Ⅱs型限制性内切酶
移动切割（shifted cleavage):
在离它的不对称识别位点一侧的
特定距离处切割DNA双链。
Hga I
5’ GACGCNNNNN
3’ CTGCGNNNNNNNNNN
35
（3）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能
Ⅱ型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。
它们识别相同的DNA序列，但功能不同。
如 EcoR I限制性内切酶和EcoR I甲基化酶
前者：5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
后者：5’-GAA*TTC-3’
3’-CTT*AAG-5
作用的位点也不相同
36
（4） II型限制性内切酶对单链DNA的切割
定义为切割双链DNA，但有一些还可以特
异识别并切割单链DNA的相应位点，只是
切割效率比较低
如：HhaⅠ切割单链DNA比
切割双链DNA效率低50％
37
3. Ⅲ类限制性内切酶
在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、
Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
EcoP1: AGACC
EcoP15: CAGCAG
在基因工程操作中用途不大。
38
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性
限制和修
饰活性
内切酶的
蛋白结构
Ⅰ类内切酶
单一多功能的酶
3种不同的亚基
Ⅱ类内切酶
内切酶和甲基 共同亚基的双功
化酶分开
能酶
单一成分
限制作用
所需要的
辅助因子
ATP、
Mg2+和SAM
EcoB：TGA(N)8TGCT
性位点识 EcoK：AAC(N)6GTGC
Mg2+
2种不同的亚基
ATP、 Mg2+和
SAM
EcoP1:AGACC
寄主特异
别序列
Ⅲ类内切酶
回文序列
（Ⅱ s型除外）
EcoP15:CAGCAG
39
切割位点
在距离识别位点 位于寄主特 距寄主特异
至少1000
异性位点或 性位点3’端24
－26bp处
bp处随机切开一 其附近
条单链
酶催转换
不能
能
能
DNA易位作用
能
不能
不能
甲基化作用的位点 寄主特异性位点 寄主特异性 寄主特异性
位点
位点
识别未甲基化的序
能
列进行切割
能
能
序列特异的切割
是
是
十分有用
用处不大
不是
基因工程中的用途 无用
40
四、限制性内切酶酶解反应条件
1. 标准酶解体系的建立
一个单位（U）的限制性内切酶定义：
在合适的温度和缓冲液中，在20μl的反应体系中，
1h完全酶解1μgDNA所需要的酶量。
推荐：稍过量的酶（2-5倍）和较长的反应时间
41
2. 酶解过程
配酶解体系
混匀
反应终止
酶解结果鉴定
42
① 酶解体系
一般20μl，保证酶液体积不超过反应总体积的
10%前提下，尽量降低反应总体积。
加样顺序一般是：
ddH2O
buffer
DNA
酶
43
大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：
Tris-HCl
50 mM pH 7.5
MgCl2
10 mM
0 - 50 mM 低盐酶
NaCl
0 - 150 mM
100 mM
中盐酶
DTT
1 mM
150 mM
高盐酶
Volume
20 - 100 ml
TT
37 ℃ 1 - 1.5 hr
44
② 混匀
移液枪吹打或手指轻弹管壁
若底物分子很大（如基因组DNA），
应避免强烈振荡。
混匀后微量高速离心机进行短
暂离心，使管壁液体全部下沉。
45
③反应终止
三种方法：
ⅰ）加乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度
10mmol/L; 加十二烷基硫酸钠（SDS）
至终浓度0.1%(W/V)
ⅱ）65℃加热20min或者70℃加热10min
ⅲ）酚/氯仿抽提
46
④ 酶解结果鉴定
快速进行微型琼脂糖凝胶电泳
观察
然后决定是否终止反应
47
酶切后发现除了目的DNA条带外，还有其它条带
酶存在“星号”活性，造成非特异性切割；
不正确的操作，导致其它内切酶污染；
底物DNA中可能存在其它DNA污染。
电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常
底物DNA不纯；
内切酶不纯；
酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起使电
泳条带移动距离异常
48
3. 限制性内切酶对DNA分子的消化
（1）内切酶与识别序列的结合模式
1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射
发现Ⅱ型限制酶是以同型二聚体的形式与靶
序列结合。
GAATTC
CTTAAG
49
（2） 完全消化
内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开
1
1
2 3
2
4
3
4
50
（3） 局部消化
只有有限数量的酶切位点被切开
1
1
2 3
4
4
通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反
应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。
51
（4） 几种常用限制酶识别位点
52
53
（5）限制性内切酶识别序列的交叉列表
AATT
ACGT AGCT ATAT
CATG CCGG
****
****
MaeII
****
HpaⅡ
cMspIc
Alu I
****
Nla Ⅲ
A****T
A****T
ApoI
Hind
Ⅲ
Afl III
AgeI
BsrFI
A****T
A****T
SspI
A****T
54
AATT ACGT AGCT ATAT
A****T
CATG
CCGG
Nsp75
24
NcoI
XmaI
StyI
AvaI
Dsa I
C****G
C****G
NdeI
C****G
Pml I PvuII
BsaAI NspBI
I
SmaI
C****G
C****G
G****C
EcoRI
ApoI
NgoMI
BsrFI55
AATT ACGT AGCT
G****C
G****C
G****C
G****C
T****A
T****A
T****A
ATAT
CATG
CCGG
BseHI
Ecl136II EcoRV
AatII
SacI
BanII
HgiAI
Bsp1286
NaeI
SphI
Nsp752
4
BspHI
BspMII
SnaBI
BsaAI
T****A
T****A
56
CGCG
CTAG
****
GCGC
GGCC
MboIc
Sau3AIc
****
****
GATC
BfaI
BstUI
HinpI
DpnI
****
HaeIII
HhaI
A****T
A****T
MluI
Afl III
SpeI
Bgl II
BstYI
A****T
A****T
Eco47III StuI
A****T
57
CGCG
CTAG
A****T
C****G
GATC
GCGC
GGCC
HaeII
DsaI
AvrII
StyI
EagI
EaeI
GdiII
C****G
C****G
NspBII
C****G
SacII
PvuI
C****G
G****C
BsiEI
BssHII
NheI
BamHI
BstYI
BsiEI
KasI
BanI
Bsp120I
58
CGCG
CTAG
GATC
G****C
GCGC
GGCC
NarI
BsaHI
G****C
G****C
G****C
T****A
T****A
T****A
BbeI
HaeII
XbaI
NruI
Bcl I
FspI
ApaI
BanII
Bsp128
6
EaeI
MscI
T****A
T****A
59
GTAC
TATA
TCGA
TGCA
TTAA
****
****
Csp61
****
RsaI
TaqI
MseI
ClaI
AseI
****
A****T
A****T
A****T
A****T
ScaI
A****T
60
GTAC
TATA
TCGA
A****T
C****G
TGCA
TTAA
Nsi I
Bsi WI
SfcI
XhoI
AvaI
AvaI
SfcI
C****G
C****G
C****G
C****G
G****C
PstI
Asp718Ba
nI
Sal I
ApaLI
61
GTAC
TATA
TCGA
G****C
AccI
AccI
G****C
Bsrl107I HincII
TGCA
TTAA
HpaI
HincII
G****C
G****C
KpnI
Bsp128
6
HgiAI
T****A
T****A
T****A
BstBI
DraI
T****A
T****A
62
4. 限制性内切酶酶解反应中的注意事项
① 大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液
1U的酶液足以在1h内消化10μg DNA，酶和底
物比例2-10U/ug DNA,避免使用过高的酶浓度
② 浓缩液使用前可用1×限制酶缓冲液稀释
③ 限制性内切酶在含50%的甘油的缓冲液
中，于-20℃稳定保存
63
④ 酶分装成小份，避免反复冻融
⑤ 反应中尽可能少加水，使反应体积减到最低
⑥ 通常增加反应时间，可降低酶量
64
五、影响限制性内切酶活性的因素
1. DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、
SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
一般采取
①纯化DNA
②加大酶的用量，1ugDNA用10U酶
③延长保温时间
④扩大反应体积（ >20l）
65
需要合适的底物：底物（DNA）纯度要高.不能含
有RNA和蛋白质;也不能含有过高的EDTA。更不能
含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他有机试剂。
DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的粘
度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻
底。常为50ul内含1ug DNA。
66
2. DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：
DNA腺嘌呤甲基化酶（DNA adenine methylas ,dam)
（修饰GATC中的A）；
DNA胞嘧啶甲基化酶（DNA cytosine ethylas ,dcm)
（修饰CCA/TGG的C）。
基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。
67
3. 温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数
是37 oC，少数要求40-65 oC。每微克DNA用1～5单
位的酶，保温1~2小时。
酶
Apa
Bcl
Mae
Taq
I
I
II
I
最适温
度oC
30
50
50
65
酶
Apy I
BstE II
Mae III
最适温
酶
o
度C
30
Ban I
60
Mae I
55
Sma I
最适温
度o C
50
45
25
68
4. 缓冲液(Buffer)
是影响限制酶活性的重要因素
商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液
（1）缓冲液的化学组成
MgCl2、NaCl/KCl：
提供Mg2+和离子强度
Tris-HCl：
维持pH,大多数为7-7.6
二硫苏糖醇（DTT）：
防止酶氧化,保持酶稳定性
牛血清白蛋白（BSA）等：中性蛋白质,防止酶在低
浓度的蛋白质溶液中变性
69
（2）两种或两种以上的酶切割DNA样品
① 在相同的缓冲液中反应同时进行
② 若需要不同的缓冲液,采用3种方法
ⅰ)先用要求低离子强度的酶切割（低盐酶）,再加NaCl调节
离子强度,并用第二种酶切割（高盐酶）；
ⅱ)先用一种酶切割,然后用2.5倍体积的乙醇沉淀酶解产物,
再重悬于另一种缓冲液中进行第二种酶切割；
ⅲ)使用所有限制性酶的通用buffer,如KGB(谷氨酸钾
buffer),经适当稀释可达到各种限制性酶要求的buffer条件。
70
练习题
何为限制性内切酶？有哪些类型，各有什么作
用和特点
什么是限制性内切酶的星号活性？受哪些因素
影响？
限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意
义是 【 】
Ａ 修复自身的遗传缺陷
Ｂ 促进自身的基因重组
Ｃ 强化自身的核酸代谢
Ｄ 提高自身的防御能力
Ｅ 补充自身的核苷酸消耗
71
第二节
DNA 连接酶
一、DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把
两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口
72
1967年，世界上数个实验室几乎同时发现了一种能
够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA
连接酶。
DNA连接酶:
一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶
73
二、DNA ligase的特点
1. 两种共价连接DNA限制片段的DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶
只能连接粘性末端，背景低，准确性高
（2）T4噬菌体的连接酶
不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端
74
2. 连接条件
（1）必须是两条双链DNA
（2）DNA3’端有游离的-OH，
5’端有一个磷酸基团（P）
（3）需要能量
动物或噬菌体中：ATP
大肠杆菌中：
NAD+
75
（4）DNA连接酶的反应条件
Tris-HCl
MgCl2
ATP
DTT
Volume
TT
50 - 100 mM，pH 7.5
10 mM
0.5 - 1 mM
5 mM
10 - 20 ml
4 - 15 ℃ ， 4 - 16 hr
1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃
反应 1 小时，完全连接 1 g l-DNA（Hind Ⅲ片段）
所需的酶量。
76
三、连接反应的机理
1. ATP（NAD+)提供激活的AMP。
2. AMP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合
物，并释放出焦磷酸PPi （NMN） 。
3. AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。
ATP
+H
PPi
3N
OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+
AMP
77
4. AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一
条链的5’端 P 上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。
-OH HO-P-
AMP
AMP
-OH O-P-
78
5. 3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸
二酯键，释放出AMP。
79
如何连接由限制性内切酶切割形成
片断的末端 ？
80
四、连接反应的温度
1. 最佳温度
连接酶反应的最佳温度是37C。
2. 实用温度
但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。
所以一般采用 4~16C
81
五、影响连接反应的因素
1. DNA末端的浓度
两种构型：线状分子和环状分子
与DNA浓度及DNA分子长度相关
2. 插入片段与载体的浓度比例
10~20倍
增加插入片段与载体的接触机会，减
少同一个分子末端自我连接的现象。
82
3. 反应温度
黏性末端：12～16℃
平头末端：10～20℃
4. ATP浓度
一般，ATP最适的终浓度为0.5mmol/L.
ATP浓度高至5mmol/L，影响平头末端的连接
ATP浓度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平头
末端的连接。
83
六、DNA连接的反应体系
酶切纯化后的DNA片断
连接缓冲液
DNA连接酶
84
七、平头双链DNA片段的连接操作
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创
造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平
头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反
应速度要慢得多。
85
提高平头末端连接效率的方法包括：
加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）
加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会
加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用
加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM
86
第三节
DNA聚合酶
DNA聚合酶（DNA polymerase)
能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖多
核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’
－OH末端，催化核苷酸的聚合作用.
87
一、基因工程中常用的DNA聚合酶
1.大肠杆菌DNA聚合酶
2. Klenow fragment
3. T7 DNA聚合酶
4. T4 DNA聚合酶
5. 修饰过的T7 DNA聚合酶
6. 逆转录酶
7.Taq DNA聚合酶
88
二、常用的DNA聚合酶的特点
1. 共同特点
把dNTPs连续地加到引物的3’－OH端
2. 主要区别
持续合成能力和外切酶活性不同。
T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不
从模板上掉下来。
其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs
就会从模板上解离下来。
89
3. 常用DNA聚合酶的特性比较
DNA聚合酶
3’5’外
切酶活性
5’3’外
切酶活性
聚合
速率
持续
能力
大肠杆菌DNA聚合酶
低
有
中
低
Klenow fragment
低
无
中
低
T4 DNA聚合酶
高
无
中
低
T7 DNA聚合酶
高
无
快
高
化学修饰T7 DNA聚合酶
低
无
快
高
遗传修饰T7DNA聚合酶
无
无
快
高
逆转录酶
无
无
低
中
Taq DNA聚合酶
无
有
快
高
90
三、DNA聚合酶在基因工程中的用途
1. 大肠杆菌DNA聚合酶 Ⅰ
主要用来制备带放射性标记的DNA探针（32P标记）。
（1）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质
①一条单链多肽
②5’3’外切酶活性位于N端
③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的
5’3’外切酶活性部分,就成为Klenow
fragment。
91
（2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件
① 底物：
dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）
② Mg2+
③ 带有3’-OH游离端的引物
④ DNA模板
dNTPs
5’
3’
-OH
92
（3）用DNA聚合酶Ⅰ制备探针
① 核酸探针（probe）
能够同某种被研究的核酸序列特异性结合
的，带有标记的寡聚核酸分子。
标记
显示位置
已知序列的核酸片断
与互补的待测序列杂交
93
② 探针的标记方式
5’
标记
已知序列的核酸片断
已知序列的核酸片断
标记 3’
带有放射性的已知序列的核酸片断
94
③ DNA聚合酶I 对探针序列的标记
a. 放射性同位素标记：
切口平移法(nick translation )：
当存在dNTP时，DNA聚合酶 I 同时具备5’3’
外切酶活性和5’3’的聚合酶活性。
95
5’3’外切酶活性从DNA缺口的下一段DNA5’端除去一
个核苷酸后，聚合酶活性就会在缺口的上一段DNA的3’
一侧补上一个新的核苷酸。
5’
缺口
缺口
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
96
纯化的DNA片断
5’
3’
DNase I制造单链缺口
3’
5’
3’
5’
5’
3’
32P-dNTP
一种-32P-dNTP和dNTPs
3’
5’
5’
3’
32P-dNTP
DNA Pol I进行切口转移
3’
5’
5’
3’
从头至尾都被标记
97
2. Klenow fragment
（1）Klenow fragment的性质
具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。
（失去了5’3’外切酶活性）。
枯草杆菌蛋白酶
DNA Pol I

Klenow fragment (76KD）
98
（2）主要用途
① 3’端补平
补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。
5’
klenow
5’
klenow
② DNA 3’末端标记
在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。
99
限制性内切酶切
EcoR I
3’隐蔽末端的DNA片断
5’----G3’
3’----CTTAA5’
根据末端的顺序选
择一种 -32P-dNTPs
-32P-dATP
25oC 1h
Klenow fragment补平
末端标记的DNA
BamH I
5’----G3’
3’----CCTAG5’
-32P-dGTP
5’----GAA3’
3’----CTTAA5’
5’----GG3’
3’----CCTAG5’
5’----GAATT3’
3’----CTTAA5’
5’----GGATC3’
3’----CCTAG5’
100
③ cDNA第二链的合成
mRNA
cDNA第一链
5’
3’
引物
cDNA第二链
逆转录
5’
3’
5’
klenow
3’
101
3. T4 DNA聚合酶
（1） T4 DNA聚合酶的性质
① 来源
从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离
纯化，由噬菌体基因43编码。
② 酶活性
有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降
解单链更快）。
102
③ 特点
A 当没有dNTP时，T4 DNA聚合酶行使3’5’外
切酶功能，制造出3’隐蔽端。
B 如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。
C 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。
103
5’
3’
无dNTPs
5’
3’
有dNTPs
3’
5’
T4 DNA聚合酶
3’
5’
T4 DNA聚合酶
5’
5’
104
（2） T4 DNA聚合酶的用途
① 补平隐蔽末端
② DNA 3’末端标记
标记末端（取代合成法或置换合成法）
用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端
（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。
再利用它的5’3’聚合酶活性补平，并加入放射性
标记的dNTP。
105
DNA酶切片断
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
无dNTPs
T4 DNA聚合酶（3’5’外切）
加入某种32P-dNTP和dNTPs
内切酶切
T4 DNA聚合酶（5’3’聚合）
酶切中间产生两
个末端标记
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’ 5’
5’ 3’
106
a. 放射性标记的优缺点：
优点：
制作简单
高比放射性
放射自显影效果好
缺点：
半衰期短（32P只有14.3天）
不易保存
对人体有害
要求在专门实验室操作
107
b. 非放射性标记
i）生物素标记
生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R
CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH
可以与dNTP酰化结合成为biotin -1,6-dUTP、
biotin -1,4-dATP、 biotin -1,1-dUTP等。
也可以被生物素连接酶（biotin ligase）催化
与蛋白质共价结合。
108
利用切口转移法将生物素掺入DNA探针中
5’
3’
纯化的DNA片断
DNase I 制造单链缺口
3’
5’
5’
3’
3’
5’
生物素-dTTP
biotin -dTTP和dNTPs
5’
3’
3’
5’
生物素-dTTP
DNA Pol I 进行
缺口转移
5’
3’
3’
5’
109
ii）地高辛标记：
可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合
成过程，形成地高辛标记的DNA探针。
地高辛的结合物是抗地高辛抗体。
生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂
盒 (kit)。
110
4. T7 DNA聚合酶
（1）来源
从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来
的，由两个亚基组成：
① T7噬菌体基因5编码的大亚基：
T7噬菌体5蛋白。
有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。
② 大肠杆菌编码的小亚基：
硫氧还蛋白。
增加大亚基对模板的亲和性。
111
（2）T7 DNA聚合酶的特点
① 持续合成能力强
一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。
②
3’5’外切酶活性高
单链和双链都能降解。
③ 不受DNA二级结构的影响
其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍
112
（3）T7 DNA聚合酶的用途
① 催化大分子量DNA为模板的合成
如M13噬菌体
② 进行末端标记
③ 补平隐蔽末端
合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端。
113
5. 修饰后的T7 DNA聚合酶
（1）T7DNA聚合酶的化学修饰
去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力
和聚合速率提高了3倍。
（2）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途
① DNA测序
双脱氧法。
② 标记DNA 3’隐蔽末端
③ 更有效地补平末端
114
6. 逆转录酶
依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。
（1）来源
RNA肿瘤病毒。
最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒
（avian myeloblastosis virus, AMV）：
（2）AMV的性质
由和两条多肽链组成，最适反应温度为41～45℃
115
① 链
有反转录活性和 RNaseH活性。
RNaseH：
以5’3’或3’5’方向特异地水解RNA-DNA杂交
双链中的RNA链。
RNA
DNA
RNaseH
RNA
DNA
116
② 链
RNA-DNA杂交双链中5’3’DNA外切酶活性。
（3）逆转录酶的用途
① 合成cDNA
以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互
补结合）。
mRNA 5’
AAAAA
TTTTT
3’
5’
cDNA
117
② 合成DNA探针
用随机引物（random primer）或oligo dT做引物。
随机引物：
随机顺序形成的寡聚DNA片断。
（理论上它能与各种序列的模板结合）
118
第四节
DNA修饰酶
一、末端脱氧核苷酸转移酶
（terminal transferase）
1. 来源
小牛胸腺。
2. 组成
大小两个亚基。
3. 特性
5’3’DNA聚合酶活性
119
① 需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。
② 不需要模板！
③ 底物可以是单链DNA、是3’—OH突出的双链
DNA、平末端需Co2+激活，但反应效率低。
④ 随机添加的dNTPs。
如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。
DNA 5’
3’
dTTP ，末端转移酶
TTT
120
4. 末端转移酶的用途
（1）同聚物加尾
给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的
同聚物尾巴，以使它们有效地连接。
5’
外源DNA
dCTP
CCC
3’
5’
末端转移酶
CCC
GGG
3’ 载体DNA
dGTP
GGG
121
便于回收克隆片断。
（2）再生酶切位点
5’AAGCTT
TTCGAA 5’
HindⅢ酶切
A
TTCGA
AGCTT
A
Klenow补平
122
AAGCT
TTCGA
dTTP
AGCTT
TCGAA
末端转移酶
AAGCATTT AGCTT
TTCGA TTTTCGAA
外源DNA
AAA
AAA
123
连接
HindⅢ位点
AAGCTTTT
TTCGA AAA
HindⅢ位点
AAA AGCTT
TTTTCGAA
（3）DNA3’－OH末端标记
催化非放射性或放射性标记物掺入DNA片断的3’端。
（生物素-11-dUTP等）
124
二、T4多核苷酸激酶
1. 来源
T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细
胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种
酶。
2. 功能
其激酶活性位于N－端附近，磷酸酶活性位于C－
端附近。
催化-磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’OH端。不论5’-OH端突出与否。
125
-OH 3’
-OH 5’
5’ HO3’ HOATP
5’ P3’ HO-
T4多核苷酸激酶
-OH 3’
-P 5’
如果ATP的-磷酸带有32P标记，就可见被转移到
DNA的5’端。
但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。
126
3. 多核苷酸激酶的用途
DNA 5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。
（1）正向反应（forward reaction）
-OH 3’
-P
5’
5’ P3’ HO碱性磷酸酶
5’ HO3’ HO-
(-32P)ATP
5’ 32P3’ HO-
-OH 3’
-OH 5’
多核苷酸激酶
-OH 3’
-32P 5’
127
（2）交换反应标记法
反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多
核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5’端
的磷酸交换。
-OH 3’
-P
5’
5’ P3’ HO-
(-32P)ATP、ADP
多核苷酸激酶
-OH 3’
-32P 5’
5’ 32P3’ HO反应效果不理想。
128
三、碱性磷酸酶
1. 碱性磷酸酶种类
（1）细菌性碱性磷酸酶
Bacterial alkaline phosphatase，BAP
从大肠杆菌中分离出来。
具有抗热性。
（2）小牛肠碱性磷酸酶
Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP
从小牛肠中纯化出来。
SDS中加热68oC可完全失活。
129
2. 碱性磷酸酶的特性
催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。
-OH 3’
-P
5’
5’ P3’ HO-
碱性磷酸酶
5’ HO3’ HO-
-OH 3’
-OH 5’
3. 碱性磷酸酶的功能
（1）防止线性化的载体份子自我连接
130
单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。
5’ AAGCTT
TTCGAA
HindⅢ酶切
A-OH 5’ P-AGCTT
TTCGA-P 5’ HO-A
碱性磷酸酶
131
A-OH
HO-AGCTT
TTCGA-OH
HO-A
OH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。
同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能与脱磷酸的
载体OH连接。
132
外源DNA
5’ P-AGCTT
3’
HO-A
连接酶
A AGCTT
TTCGA A
A-OH 3’
TTCGA-P 5’
-OH与-OH连不住
A AGCTT
TTCGAA
其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。
133
第五节
核酸外切酶（ Exonucleases）
是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷
酸的酶。
一、单链DNA外切酶
1. 大肠杆菌核酸外切酶I（exo I）
5’3’外切
识别5’-OH
2. 大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exo Ⅶ）
5’3’、3’5’外切
识别3’-OH、5’-P
134
二、双链DNA外切酶
1. 核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ）
3’5’外切
识别3’-OH
主要用途：
在DNA双链的末端产生出单链区域。
-OH
5’
5’
HO5’
exo Ⅲ
与klenow配合进行3’端标记
5’
135
2. l核酸外切酶（l exo）
5’3’外切。
识别5’-P（但不能降解5’-OH）
主要用途：
使DNA双链变成单链（短）。
5’ P5’
l exo
-P 5’
5’
成为测序模板。
136
3. T7基因6核酸外切酶
5’3’外切。
既能识别5’-P，又能识别5’-OH。
5’
5’
5’
5’
用途与l exo一样。
已被克隆到大肠杆菌中表达。
137
DNA外切酶
单
链
双
链
大肠杆菌核酸外切酶I
（exo I）
大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ
（exo Ⅶ）
切割方式
5’3’
识别位点
5’-OH
5’3’
3’5’
核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ） 3’5’
5’-P
3’-OH
3’-OH
l核酸外切酶（ l exo） 5’3’
5’-P
T7基因6核酸外切酶
5’3’
5’-P
5’-OH
138
第六节
单链DNA内切酶
一、S1核酸酶
1. 来源
稻谷曲霉（Aspergillus oryzae）。
2. 特性
（1）高度单链特异性
（2）反应条件
① 低水平Zn2+
② pH4.0~4.3
139
3. S1核酸内切酶的功能
（1）催化单链RNA或DNA降解。
（2）切掉双链核酸中的单链区。
发卡或有缺口的部位。
S1
S1
140
甚至能识别单个核苷酸的单链区！
T
TACGTA CGTACG
ATGCAT GCATGC
（3）降解限制酶切形成的单链突出端。
（4）几乎不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链
141
4. S1核酸酶的用途
（1）定位RNA
某限制酶位点（参照物）
DNA
某限制酶切后再与RNA杂交
RNA
S1
RNA
200bp
S1
400bp
内切酶位点不能位于内含子序列中！
142
RNA位置
RNA位于某限制酶位点左200bp和右400bp。
（2）用mRNA测定基因中的外显子序列
不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。
DNA
mRNA
143
二、Bal 31核酸酶
1. 来源
埃氏交替单胞菌（Alteromonoas espejiana）
2. 功能
既有单链特异的DNA（RNA）内切酶；
又有双链特异的DNA外切酶。
降解双链DNA或其上的单链缺口、未配对的
单链区域。
144
3. 反应条件
Mg2+、Ca2+
EGTA（乙二醇双四乙酸）专一性螯合Ca2+，
可终止反应。
4. Bal31的用途
定位测定DNA片断中的限制酶位点分布。
Hind III
EcoR I
BamH I
EcoR I
145
Bal31控制消化法：
①用Bal31消化线性DNA，并在不同的时间加
入EGTA终止反应，再酶切电泳。
②与对照组（不用Bal31消化）只用相同的酶切
的电泳比较。
③根据酶切片断消失的先后顺序，判断这些片断
在原DNA中的位置。
146
Hind III
EcoR I
BamH I
EcoR I
分别用各个内切酶切后电泳，记录片断
数目和大小。
147
Hind III
EcoR I
BamH I
EcoR I
Bal31
Hind III
EcoR I
BamH I
EcoR I
分别用原内切酶切后电泳，
判断片断数目和大小。
148
149
150