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Métodos espectroscópicos para la caracterización de macromoléculas biológicas • Interacción de radiación electromagnética con la macromolécula en estudio Se usa amplio rango del espectro electromagnético (desde radiofrecuencia hasta RX) • • Cada una aporta distinta información estructural Regiones útiles en espectroscopía de biopolímeros Técnicas espectroscópicas • ABSORCIÖN (UV-VIS, IR) • EMISIÓN (fluorescencia) • DISPERSIÓN ( Raman) • DIFRACCIÓN ( Rayos X) • Luz polarizada (dicroismo circular) • Resonancia (RMN, EPR) Absorción en el uv-vis 100 - 400 nm UV 400 – 700 nm VISIBLE Absorción en el infrarrojo 700 nm – 2.5 μ transición electrónica transición vibracional Aplicaciones de la espectroscopía de absorción uv-vis • Cualitativa, Identificación de cromóforos por el espectro A vs • Cuantitativa, medir la concentración del cromóforo A = ε b C Las proteínas absorben en el uv-vis? ABSORBANCIA max ε (M-1 cm-1) (nm) Triptofano 278 287 5600 4500 Tirosina 275 1400 Fenilalanina 258 200 Espectro de absorción uv de una proteína, seroalbúmina bovina (BSA) Espectro de BSA 0.45 µM en buffer fosfato pH 7.0 Espectro de absorción uv de seroalbúmina bovina BSA Absorción uv-vis de Proteínas Absorción en el uv de residuos aromáticos Estimación del coeficiente de absortividad molar de una proteína ε 280 (M-1 cm-1) = 5500 x n(Trp) + 1490 x n(Tyr) + 125 x n(SS) n(Trp) = número residuos de triptofano en la secuencia n(Tyr) = número residuos de tirosina en la secuencia n(SS) = número de enlaces disulfuro en la proteína Cambio espectral de la tirosina cuando se desprotona (pKa = 10.9), el máximo de absorción pasa de 280 nm a 295 nm Titulación espectrofotométrica de Ribonucleasa pancréatica bovina RNasa tiene 6 residuos de tirosina Espectro uv de la RNasa en función del pH Cambio espectral de la tirosina cuando se desprotona (pKa = 10.9), el máximo de absorción pasa de 280 nm a 295 nm RNasa tiene 6 residuos de tirosina. El resultado muestra que unas 3 tirosinas se titulan reversiblemente con un pKa = 10.2 Las otras 3 tirosinas no se titulan hasta alcanzar un pH más elevado que provoca la desnaturalzicación de la proteína Absorción a 295 nm en función del pH Los ácidos nucleicos, absorben en el uv-vis? Absorción en el UV lejano de los ácidos nucleicos Cromóforo, responsable de la absorción, las bases nitrogenadas Diferencias en estructura secundaria, afecta el espectro de absorción uv? Cuando tenemos más de un grupo que absorbe: La orientación relativa de los cromóforos y las interacciones entre cromóforos, afecta la energía e intensidad de la absorción Polipéptido con estructura “ovillo estadístico”, es el espectro de una amida (―). Polipéptido con estructura αhélice (…) que tiene grupos amida orientados y que interaccionan unos con otros, el espectro cambia: banda a 195 nm menos intensa y hombro a 205 nm Seguir la desnaturalización de la proteína por cambios en la absorción uv Inserto: Espectro de absorción uv de RNasa nativa y desnaturalizada (8 M urea) Espectro diferencial Seguir la desnaturalización de la proteína por cambios en la absorción uv Cambios de absorción de RNase a 286 nm y 292 nm al aumentar la temperatura Cuando tenemos más de un grupo que absorbe: La orientación relativa de los cromóforos y las interacciones entre cromóforos, afecta la energía e intensidad de la absorción Espectro de absorción uv de ADN de doble cadena (línea sólida), ADN cadena simple (línea de trazos) y tras hidrólisis hasta obtener nucleótidos libres (línea punteada). Todos los espectros a igual concentración de bases. HIPOCROMISMO Aplicación del efecto hipocrómico para seguir desnaturalización de ADN Al perder estructura secundaria, los residuos nucleotídicos pierden rigidez, se desordenan, entonces la intensidad de absorción a 260 nm aumenta (se pierde efecto hipocrómico). Se determina Tm (temperatura a la cual la mitad de ADN se desnaturalizó) Cambios espectrales por perturbación del solvente A) Triptofano (N-acetil éster)(a),Tirosina (b), Fenilalanina (c) en agua (línea sólida) o en 20%DMSO (línea punteada) B) Espectros diferenciales Aplicaciones espectroscopía de absorción uv-vis • • • • Identificación Cuantificación Cinética Determinación de parámetros estructurales: desnaturalización ubicación de residuos ionización de residuos asociación con ligandos