Stanična signalizacija

1

o

2

3

Stanična signalizacija

• Više razina stanične signalizacije – Endokrina • stanice koje proizvode signalne molekule su prostorno udaljene • izlučuju se glasničke molekule • prijenos putem krvi ili izvanstanične tekućine • ciljne stanice – membranski receptori » Unutarstačni učinak aktivacijom enzimskih kaskada – citoplazmatski receptori » specifičan transportni sustav za prijenos signalnog kompleksa u jezgru 4

Stanična signalizacija

• Više razina stanične signalizacije 5

Stanična signalizacija

• Više razina stanične signalizacije – Parakrina • slična endokrinoj signalizaciji • glavne razlike – ciljne stanice u istom tkivu – glasničke molekule prenose se kroz izvanstanični matriks ili tekućinu – Autokrina • stanična autosignalizacija 6

Stanična signalizacija

• Adhezija • interakcija stanica-stanica – stanice identificiraju druge obližnje stanice • interakcija stanica-izvanstanični matriks – stanice identificiraju fiziološko okruženje 7

Integrini

• Glavni receptori za prijanjanje stanica na izvanstaničnu tvar i aktivatori unutarstaničnih signalnih puteva • Povezivanje integrina i izvanstanične tvari → interakcija citoplazmatske domene integrina i nereceptorske protein-tirozin kinaze FAK (engl. focal adhesion kinase) → autofosforilacija tirozina u FAK 8

Signalizacija integrinima

• Fosfotirozni FAK – vezno mjesto za signalne molekule s SH2- domenama (Src – porodica nereceptorskih protein tirozin-kinaza) → daljnja fosforilacija tirozina u FAK → vezna mjesta za SH2-domene drugih signalnih molekula (fosfolipaza C, PI 3-kinaza) Protein protein interakcije igraju važnu ulogu u staničnom rastu i razvoju. Modulatorne domene, koje su podjedinice proteina, upravljaju interakcijama proteina prepoznavanjem kratkih sekvenci peptida. Te sekvence peptida određuju vezivanje partnerskihproteina. Jedan od više istaknutih domena je SH2 domena. SH2 domene igraju vitalnu ulogu u staničnoj komunikaciji. Njihova dužina je oko 100 aminokiselina a nalazi se unutar 115 ljudskih proteina.

9

Signalizacija integrinima

• Povezanost stanične adhezije i signalnih puteva koji nadziru gensku ekspresiju, staničnu proliferaciju i stanično preživljavanje 10

Signalizacija glasničkim molekulama

• Dušikov oksid i ugljikov monoksid • Peptidni hormoni i čimbenici rasta • Steroidni hormoni • Neurotransmitori • Eikozanoidi 11

Dušikov oksid

• Dušikov oksid (NO) – glavna parakrina signalna molekula u živčanom, imunološkom i cirkulacijskom sustavu • Kroz staničnu membranu prolazi difuzijom • Mijenja aktivnost unutarstaničnih ciljnih enzima – vezuje se na cisteinske ostatke (nitrozilacija) – nestabilan (t1/2 nekoliko sekunda), lokalni učinci 12

Dušikov oksid

• Nastaje u ciklusu ureje • dilatacija krvnih žila – neurotransmitori (acetilkolin) potiču sintezu NO u endotelnim stanicama stijenki krvnih žila – NO difundira u susjedne mišićne stanice i potiče gvanil-ciklazu na stvaranje cGMP što uzrokuje relaksaciju mišićnih stanica i dilataciju krvnih žila – nitroglicerin: oslobađa NO → dilatacija koronarnih žila → ↑ protok prema srcu 13

Ugljikov monoksid

• Ugljikov monoksid – nastaje djelovanjem hem oksigenaze – signalna molekula u živčanom sustavu – aktivira gvanil-ciklazu → ↑ cGMP – sinteza CO potaknuta neurotransmitorima – posrednik u dilataciji krvnih žila

antioksidans

14

15

Peptidni hormoni

16

Steroidni hormoni

• Testosteron • Estradiol • Progesteron • Glukokortikoidi – kortizol • Mineralokortikoidi – aldosteron 17

Neurotransmiteri

Prenose signale između živčanih stanica ili od živčanih stanica do drugih vrsta stanica Hidrofilne molekule, vežu se na specifične receptore na staničnoj membrani 18

Vrste receptora

• Receptori za steroidne hormone • Receptori povezani s G-proteinima • Receptorske protein-tirozin-kinaze • Receptori za citokine i nereceptorske protein tirozin-kinaze • Receptori povezani s ionskim kanalima 19

Receptori za steroidne hormone i slične molekule

• Prisutni u citoplazmi ili jezgri • Potiču ekspresiju gena vezanjem na DNA – enzimska indukcija 20

Djelovanje tireoidnog hormona

• Receptor je vezan na DNA • Vezanje hormona mijenja konformaciju, a time i transkripcijsku aktivnost receptora 21

Djelovanje estrogena

• Sam receptor ne veže DNA • Vezanje hormona izaziva promjenu konformacije receptora • Aktivni kompleks veže DNA i potiče transkripciju ciljnog gena 22

Ligandi nuklearnih receptora

• Steroidi – e strogen (ER α,β) – p rogesteron (PR) – a ndrogeni (AR) • Nesteroidni lipofilni hormoni – 1,25-(OH) 2 -vitamin D 3 (VDR) – a ll trans -retinoična kiselina (RAR α,β, γ) – 9-cis retinoična kiselina (RXR α,β, γ ) – m asne kiseline (PPAR α,β, γ) – t iroidni hormon (TR α,β) • Ostali (bez liganda ili je ligand nepoznat) 23

Ligandi nuklearnih receptora

• Ulaskom u stanicu, steroidni hormoni i slični ligandi vežu za se unutarstanične receptore – superporodica receptora u jezgri – Transkripcijski čimbenici • domena za vezanje liganda • domena za vezanje DNA • domena za aktivaciju transkripcije Vezanje liganda mogućuje aktivaciju ili inhibiciju ciljnih gena 24

Receptori udruženi s G proteinima

• Receptori sa sedam transmembranskih domena – progesteronski receptori – β-adrenoceptori

Izvanstanična domena

-S-S-

Transmembranska domena Unutarstanična domena adrenoceptor

25

α

26

Mnogi hormoni (adrenalin, glukagon...) vezanjem na receptore mehanizme aktivacije (ili inhibicije) adenilat ciklaze pokreću pomoću G proteina 27

Receptori tirozinskih kinaza

• Skupina receptora povezana s unutarstaničnim enzimima • Fosforiliraju tirozinske bočne ogranke • Receptori za polipeptidne čimbenike rasta – nadzor rasta i diferencijacije životinjskih stanica • 58 receptorskih protein-tirozin-kinaza (receptori za EGF, NGF, PDGF, inzulin...) 28

Receptori tirozinskih kinaza

• Građeni od 1 polipeptidnog lanca (inzulinski receptor i slični receptori imaju 2 polipeptidna lanca) – izvanstanična domena na N kraju za vezanje liganda – transmembranska α uzvojnica – citosolna domena na C-kraju koja ima protein-tirozin kinaznu aktivnost 29

Receptori tirozinskih kinaza

30

Superporodica citokinskih receptora

– Nemaju katalitičku domenu – Interakcija s nereceptorskim protein-tirozinskim kinazama – Src porodica – JAK porodica 31

Superporodica citokinskih receptora

• JAK/STAT put - izravna veza između protein-tirozin-kinaza i transkripcijskih čimbenika • STAT proteini (engl. signal transducers and activators of transcription) – smješteni u citoplazmi – aktivacija citokinskih receptora privlači STAT proteine koji se vežu za fosfotirozine u citoplazmatskim domenama receptora → fosforilacija STAT pomoću JAK (nereceptorske protein-tirozin → transkripcija ciljnih gena kinaze) → dimerizacija STAT → premiještanje u jezgru 32

e

33

34

35

Putevi unutarstaničnog prijenosa signala

• Put cAMP i cGMP • Put MAP-kinaze • Put JAK/STAT (vidi superporodicu citokinskih receptora) • Fosfolipidi i Ca 2+ • Apoptoza 36

37

38

cGMP

• Ciklički GMP (cGMP) = drugi glasnik • Nastaje iz GTP djelovanjem gvanil-ciklaze, a razgrađuje do GMP djelovanjem cGMP-fosfodiesteraze • Gvanil-ciklazu aktiviraju NO, CO, peptidni ligandi • Djelovanje cGMP posredovano protein-kinazom ovisnom o cGMP • cGMP – nazornik ionskih kanala i drugih ciljnih proteina 39

Putovi mitogenom aktivirane protein (MAP) kinaze

• MAP kinaze predstavljaju superporodicu serinsko/treoninskih kinaza • MAP-kinazni putovi su povezani s: – proliferacijom i apoptozom – diferencijacijom i transformacijom – kontrakcijom krvnih žila 40

Putovi mitogenom aktivirane protein (MAP) kinaze

• 3 glavna člana obitelji MAP kinaza: – ERK (extracellular signal-regulated kinase) – JNK (c-jun N-terminal kinase) – p38 • ERK se aktivira u odgovoru na čimbenike rasta i diferencijacije – povećava ekspresiju "gena ranog odgovora" c-fos, c myc i c-jun, sintezu DNA • JNKs i p38 se aktiviraju kao odgovor na upalne citokine i stanični stres 41

Kaskada mitogenom-aktivirane proteinske kinaze (MAPK) Podražaj MAPK kinaza kinaza Čimbenici rasta, ROS/RNS

Raf

MAPK kinaza MAPK Odgovor

MEK1/2 ERK1/2

Stanični rast, diferencijacija Citokini Stanični stres (osmotski stres, ROS)

MEK3 p38 MEKK MEK4 JNK1/2

Odgovor na stres 42

Uzvodni regulatori ERK1/2

• Aktivaciju ERK pokreće vezanje stimulusa na receptore • SHC-Grb2-Sos kompleks potiče razmjenu GDP-a za GTP na Ras • MEK je reguliran kinazom Raf • MKP-1 defosforilira i inaktivira ERK, JNK/SAPK i p38 MAP kinaze 43

Nizvodna regulacija s ERK1/2

Fosforilirana ERK aktivira: 1) proteine uključene u poticanje transkripcije (Elk-1, TAL 1, RNA polimeraze II) 2) proteine uključenu u sintezu proteina (PHAS I) 3) strukturalne proteine (mijelinski bazični protein (MBP), mikrotubul vezane proteine (MAP), kaldezmon) 4) signalne proteine (PLA2, S6 kinazu, Ca 2+ kanale, Na + /H + crpku i dr.) 44

Aktivacija transkripcijskih čimbenika

• MAPK/AP-1 (aktivatorski protein-1) • NF  B (nu klearni čimbenik–  B) Proliferacija Preživljavanje Apoptoza/smrt Upala Preživljavanje Kontrola staničnog ciklusa 45

Nuklearni čimbenik-kappaB ( NF-κB )

Proteinski kompleks koji kontrolira transkripciju DNA. uključen u stanični odgovor na podražaje kao što su stres, citokini, slobodni radikali, ultraljubičasto zračenje, oksidirani LDL, bakterijski i virusni antigeni

46

IL-1 β: interleukin 1β TNF α: čimbenik nekroze tumora-α TRAF-2: TNF receptor pridružen čimbenik 2 NIK: NF κB inducirajuća kinaza IKK: I κB-kinaza I κBα: inhibitor NF-κB

Aktivacija NF-κB

PC PLC: fosfatidilkolin specifična fosfolipaza C DAG: diacilglicerol PKC: protein kinaza C MAPK: mitogenom aktivirana protein kinaza P65/p50: NF κB kompleks Transkripcija gena

47

Aktivacija NF-κB

48

Tvorba aktivatorskog proteina –1 (AP-1)

stimulus

c-

fos

c-

jun

mRNA mRNA

intermediate

AP-1

Stanična proliferacija, itd.

49

Mossman & Stern 9

č

50

51

Fosfolipidi i Ca

2+ • Stimulacijom PLA2 oslobađa se arahidonska kiselina (AA) iz fosfolipida • AA se ciklooksigenazama, lipoksigenazama i citokrom P450 oksigenazama pregrađuje u eikosanoide 52

53

Fosfatidilinositol-3-hidroksi-kinaza (PI3K)

• Katalizira dodavanje fosfata na 3 poziciju ugljikohidratnog prstena fosfatidilinozitola – proizvodi: • PI 3,4-bifosfat (PIP2) • PI 3,4,5-trifosfat (PIP3) • ostaju u citosolnom dijelu lipidnog dvosloja • membranski-vezani lipidni glasnici – razne funkcije u mnogim tipovima stanica 54

Fosfatidil-inozitol-3,4,5-trifosfat (PIP3)

• Jedan oblik PI3-kinaze se aktivira pomoću G proteina, a drugi putem SH3-domena • Fosforilacijom PIP2 nastaje fosfatidil-inozitol-3,4,5-trifosfat (PIP3) = drugi glasnik • PIP3 djeluje na protein serin/treonin kinazu Akt koja je važna za preživljavanje stanice 55

Inozitol-1,4,5-trifosfat (IP3)

• Potiče otpuštanje Ca 2+ iz unutarstaničnih spremnika • Niska razina Ca 2+ u stanici (0,1 μM) održava se djelovanjem Ca 2+ -crpki – prijenos izvan stanice i u endoplazmatski retikul • IP3 se veže na Ca 2+ -kanale – otpuštanje Ca 2+ iz ER – aktivacija protein-kinaza i fosfataza 56

Aktivacija fosfolipaze C (PLC)

• Fosfolipaza D (PLD) hidrolizira fosfolipide te nastaju fosfatidne kiseline – kritične komponente u staničnoj signalizaciji povezane s mitogenezom • djelovanjem fosfohidrolaze fosfatidne kiseline nastaje DAG – aktivacija protein kinaze C (PKC) • PLD-ovisna signalizacija utječe na kontrakcije srca i krvnih žila stvaranjem superoksid aniona stimulacijom NADH/NADPH oksidaze 57

58

NSAID (engl. nonsteroid anti inflammatory drugs) = nesteroidni protuupalni lijekovi 59

60

61

Receptor vezan s G-proteinima Receptorska tirozin kinaza

62

Važnost stanične signalizacije u razvoju proliferativnih bolesti poput raka ili fibroze Stanična signalizacija Produkti gena •proteini •transkripcijski čimbenici (In)aktivacija transkripcije gena Biolo ški učinak •stanična proliferacija •stanična transformacija •stanična smrt/apoptoza Bolest 63

Apoptoza

• Apoptoza – morfološke promjene tijekom programirane stanične smrti – kontroliran proces, uz trošenje energije, bez imunološkog odgovora • Nekroza – nekontrolirano “raspadanje” stanica uz imunološki odgovor • Kaspaze – regulacija apoptoze – porodica cisteinskih proteaza (Cis u aktivnom centru) – izvršitelji programirane stanične smrti koji uzrokuju apoptozu kidanjem ciljnih staničnih proteina (inhibitor DNAaze, jezgreni laminini) • Kaspaze se sintetiziraju kao inaktivne preteče, aktiviraju se djelovanjem drugih kaspaza 64

65

• Vanjski put – kaspaza 8 • Unutarnji put – p53 – mitohondrij • citokrom c

mitohondri j

Apoptoza

izvršne kaspaze

66

Put PI3K/Akt

• PI3K/Akt/mTOR signalni put ima značajnu ulogu u apoptozi i nastanku tumora – Akt = protein kinaza B – inhibira aktivnost proapoptotičkih čimbenika 67

68