Transcript 7. predavanje

MOLEKULARNA
PATOFIZIOLOGIJA
TUMORSKOG
PREOBRAŽAJA
SOMATSKIH STANICA
Prof. dr. sc. Nada Oršolić
Zavod za animalnu fiziologiju
HOMEOSTAZA MASENE TKIVNE RAVNOTEŽE

Fiziološka tkivna masena ravnoteža se
održava usklađenom:
kontroliranom diobom
kontroliranim odumiranjem stanica.

U tumorskim bolestima zbog povećanja
mase dolazi do poremećaja masene
ravnoteže.
Molekulska patogeneza tumorskog
rasta i nastanka raščlanjena u četiri
koraka:
1. nestabilnost genoma,
2. stjecanje diobotvorne neovisnosti
stanice,
3. preživljavanje u nepovoljnom
unutarnjem okolišu
4. metastaziranje tumora
Tumorski preobražaj uzrokuju
•strukturnim i funkcijskim promjenama gena koji mogu
uzrokovati tumorski preobražaj stanice.
Nestabilnost genoma
uzrokuje sklonost
Stečena ili/i naslijeđena
nestabilnost genoma
preduvjet je pokretanja
diobotvornih
nekontroliranih
mehanizama koji nastaju
virusni proteini
•1.Mikrosatelitska nestabilnost, koja se očituje
promjenom dužine mikrosatelita.
•2. Kromosomska nestabilnost koja uključuje, strukturne
promjene u kromosomu kao i promjene u broju
kromosoma.
• Aktiviranjem protoonkogena,
• disfunkcijom protuonkogena,
• kočenjem apoptotskih mehanizama, ili
• kombinacijom nekoliko tih uzročnika.
• interferencijom s dioboupravnim molekulskim procesima
uzrokovati tumorski preobražaj.
Stanice koje su stekle diobotvornu neovisnost
prolaze treći korak preživljavanja u nepovoljnom
okolišu, pri čemu moraju svladati:




genomsku,
imunonadzornu i
energijsku barijeru
Na tom se selektivnom koraku gubi velika masa
novostvorenih stanica, što određuje relativno
sporu kinetiku tumorskog rasta.
Bitni čimbenici za rast tumora:
Tumor
DIOBOUPRAVNI I SAMOUBOJSTVENI MEHANIZMI
SOMATSKIH STANICA ODREĐUJU HOMEOSTAZU
MASENE TKIVNE RAVNOTEŽE

Preživljavanje složenog višestaničnog organizma
ovisi o:




funkciji posebno diferenciranih somatskih stanica koje
oblikuju tkiva,
o energijskoj i
informacijskoj homeostazi.
Fiziološka se homeostaza tkiva i tkivnih funkcija
održava ravnotežom između strogo nadzirane
diobe stanica i njihove kontrolirane smrti.
SIGNALI POBUDE I SIGNALI KOČENJAFunkcijska i strukturna homeostaza

Stanice primaju i odašilju komunikacijske signale pobude:






Istodobno, stanice primaju i odašilju signale kočenja.
Trenutni se zbir pobuda i kočenja integrira i to određuje fiziološko
ponašanje stanice.
Na molekulskoj se razini signali pobude u stanicama očituju:





autostimulatornim,
parastimulatornim i
jukstastimulatornim mehanizmima.
lučenjem molekula,
pokretanjem staničnog ciklusa u smislu diobe,
promjenom izražaja dijelova genoma te
pokretanjem programirane smrti stanica.
Funkcijska i strukturna homeostaza fizioloških tkiva se odražava u
selektivnim prilagodbama koje se očituju na tkivnoj, staničnoj
te molekulskoj razini.
Prijenos informacija

Prijenos informacija se ostvaruje:







proteinsko-proteinskim međudjelovanjima
fosforilacijama proteina,
proteinsko-DNA-interakcijama,
lipidnim signalima,
lipidacijom proteina te
ionskim prijenosom signala.
Prijenosi signala u citoplazmi se sastaju na nekim križnim
točkama različitih putova, koje time postaju integracijske
točke na kojima se zbrajaju negativni i pozitivni signali. Takve
točke fizioloških križanja putova signala su potencijalna
mjesta za nastanak aberantne pobude stanice.
PRIJENOS INFORMACIJAPROCES SIGNALIZACIJE
Prijenos signala -signalizacija


Prijenos signala evoluirao u cilju da pojedine
stanice mogu odgovoriti na njihov izvanstanični
okoliš.
Važna u komunikaciji između stanica unutar
tkiva i između tkiva:




održavanje morfologije tkiva
zacjeljivanje rana,
prepoznavanje i uklanjanje mikroba,
održavanje homeostaze.
Mehanizam signalizacije
Ligand
Receptor
P
Aktivna fosforilacija/defosforilacija
Transkripcija
Transkrpcija
gena
Adaptor protein
nukleus
MAP kinaze,
• čimbenici transkripcije
- Vezanje na konsenzus slijed
promotora
- Može stvoriti komplekse
- Može se sama transkribirati
i izazvati staničnu aktivaciju
Efektorni enzim
Tipovi signala

Fiziološki signali iz vanjskog mikrookoliša


Patološki signali iz vanjskog mikrookoliša




Susjedne stanice, izvanstanični matriks, citokini i faktori rasta, hormoni, glukoza,
amino kiseline, ioni itd
molekularnih uzoraci vezani za opasnost (DAMPs)
Patogeni molekularni uzorci (PAMPs)
Upala i imunološke stanice
Interni homeostatski signali

Odgovor na DNA i mitohondrijska oštećenja, ROS, hipoksija, metabolizam, itd
Većina signali se prenosi putem vezanja liganda za specifične
receptore na površini stanice, čime se mnogi vanstanični
podražaji mogu razlikovati
Više signalnih puteva sudjeluje u stvaranju
odgovora
Peptide hormones
Odorants
Chemoattractants
Neurotransmitters
Taste Ligands
G-proteinR
Hormones
Lipid kinases
Steroid R
Extracellular
Protein kinase R
Cadherins
GTP GDP
matrix
Integrins
Tumor necrosis TNFR
Pathogen
Factor family
family
Associated
Toll-likeR Molecular
Cytokines CytokineR Nucleus
Patterns
(PAMPs)
GlucoseR/
Damage Associated
Ion channels
Molecular Patterns
(DAMPs)
Growth Factors
Nucleus
• Više signala integrirano za generiranje odgovarajućeg biološkog odgovora,
bilo da je to smrt stanica / opstanak, zastoj staničnog ciklusa / progresija,
glikoliza / aerobik metabolizam, popravak DNA / stabilnost
Početni korak je aktivacija receptora ligandom izazvanih
pomoću oligomerizacije
Inaktivni receptori
Cytokine Receptor
RTK (EGFR, PDGFR)
Aktivirani receptori
ATP
autophosphorylation
ADP
• dovodi do aktivacije receptora kinaza ili konformacijskih promjena koje
omogućuju vezanje na adapter proteine ​te aktivaciju kaskadne reakcije
Receptor se može povezivati s drugima -sinergizam npr erbB1 i 3 - može biti
važnan u izbjegavanju odgovora na terapiju
Čimbenici rasta
Čimbenici rasta
Tirozin kinaze
Fosfolipaza C
Ras/G
PI3 kinaze
Aktivacija MAP kinazne kskade (Ser/treonin kinaze)
Aktivacija transkripcijski
čimbenika
Geni odgovorni za rast
Glavni igrači kinaze
Tirozin kinaze (100
gena)
Serin / treonin
kinaze (400) gen
Receptori faktora
rasta (RTK, 60 gena)
Citoplazmatski (35-40
geni) Jak, Src, Fak,
Tec ...
MAP kinaze, TGFβR, PKC, ATM
Kinaze dvojne
specifičnosti
MEK (dvostruke treonin
i tirozin kinaze)
Fosfataza
PTEN, Cdc25kontrola
fosforilacije.
Tirozin kinaze,
Receptorske (EGFR,FGFR,PDGFR)
Ne- receptorske (JAK,src,Abl,MAPK)
 Serine treonine (PKC, Plk,Rho Kinases)
Nekoliko primjera receptora TK

Epidermal Growth Factor
Receptor family
•
erbB1 (c-erbB)
•
erbB2 (neu)
•
erbB3
•
erbB4

Fibroblast Growth Factor
Receptor family
•
FGFR-1(fig)
•
FGFR-2(K-sam)

Platelet Derived Growth Factor
Receptor family
•
CSF-1R (c-fms)
•
SLF R (c-kit)


Insulin Growth Factor Receptor
Family
 IGFR-1 (c-ros)
Neurotrophins
 NGFR (trk-A)
 BDNFR (trk-B)
 NT3 R (trk-C)
RTK
Aktivirani receptor tirozin
kinaza (RTK)
1. vezanje liganda
2. Dimerizacija
3. Autofosforilacija
Fosforilacija

Promjena aktivnosti enzima iniciranjem kaskadne reakcije


Indukcija vezanja DNA


STAT i c-jun transkripcijski aktivnosti
Promjena substanične lokalizacije proteina



npr MAP kinazni put iniciran aktivacijom EGFR pomoću autofosforilacije.
primjerice, regrutiranjenje adaptera na aktivirane receptore,
nuklearna lokalizacija hormonskih receptora
Promjena stabilnosti proteina

fosforilacija dovodi do degradacije ili stabilizacije - p27, IkBα, p53, itd.
Prijenos signala u stanici
1. DNA specifičnost i afinitet
vezanja
2. Transaktivacijska aktivnost
Transkrpcijski
čimbenici
1. Faktori rasta i /ili
faktori inhibicije
2. Izvanstanične
komponente
3. Stanica-stanica
adhezijske
interakcijske molekule
1. Protein-protein interakcija
2. Fosforilacija i defosforilacija
3. Lokalizacija
-Normalne stanice primaju signale iz okoline koja ih okružuje
-poremećaj stanične signalizacije je ključan u nastajanja tumorskih stanica
- stanica - stanica komunikacija je presudna za koordinirano djelovanje pojedinih
stanica u višestaničnom organizmu
Čimbenici rasta – biološki učinci
- proliferacija stanica
- stanična diferencijacija
- apoptoza
- lokalna upalna reakcija
- angiogeneza
- stvaranje međustaničnog matriksa
- progresija staničnog ciklusa
Faktori rasta i stanični ciklus
Transkripcija gena
+
Receptors
S
Priming
G0
G1
Stanični ciklus
M
G2
Čimbenici staničnog rasta
čimbenik
struktura
učinak
receptor
___________________________________________________________________
EGF
130 kDa (prekursor)
mitogen
EGFR, RTK
6 kDa (fragment)
(epitelne stanice)
TGFα
25 kDa (prekursor)
6kDa
mitogen
EGFR, RTK
(epitelne stanice)
Amfiregulin
14-22 kDa
mitogen
HB-EGF
14-20 kDa
EGFR, RTK
mitogen
EGFR/Erb4
kemoatraktant
RTK
Betacelulin
32 kDa
mitogen
EGFR/ErB4
(stanice dojke)
RTK
___________________________________________________________________
Čimbenici staničnog rasta
Čimbenik
struktura
učinak
receptor
____________________________________________________________________
Heregulin
42-59 kDa
diferencijacija
ErB3-4, RTK
maturacija
PDGF-A/B
30 kDa
16-18 kDa (PDGF-A)
12 kDa (PDGF-B)
kemotaksija
mitogeneza
PDGFRα
PDGFRβ
FGF 1-9
17-30 kDa
mitogeneza
angiogeneza
FGFR1-4, RTK
IGF-1
IGF-II
7, 5 kDa
proliferacija
diferencijacija
preživljenje
IGF-IR, RTK
INS-R, RTK
Čimbenici staničnog rasta
Čimbenik
struktura
učinak
receptor
_____________________________________________________________________
NGF
13-25 kDa
mitogen
trkA, RTK
BDNF
prekursor
diferencijacija
trkB, RTK
(neuroni)
NT3
trkC, RTK
NT4
trkB, RTK
GDNF
20kDa
preživljenje
(neuroni)
ret, RTK
VEGF
34-46 kDa
mitogen
(endotel)
Flt-1/FlK-1, RTK
_____________________________________________________________________
Čimbenici staničnog rasta
Čimbenik
struktura
učinak
receptor
______________________________________________________________
_
CSF-1
70-90kDa
proliferacija
c-fms, RTK
(makrofagi)
SCF
31-36 kDa
Flt-3L
30 kDa
proliferacija
c-kit, RTK
diferencijacija
migracija
hemotopoetskih stanica
proliferacija
flt-3 RTK
hemotopoetskih
progenitora
_____________________________________________________________
Čimbenici staničnog rasta
Čimbenik
struktura
učinak
receptor
_____________________________________________________________________
HGF
60 kDa i 30 kDa
pokretljivost
met RTK
morfologija
epitelnih i endotelnih
stanica
MSP
47kDa i 22 kDa
pokretljivost
ron RTK
morfologija
makrofaga
efrinA1-5
21-28 kDa
mitogen
EphA1-8
efrinB1-3
34 kDa
EphB1-6
Gas 6
75 kDa
mitogen
Axl RTK
Sky RTK
_____________________________________________________________________
Čimbenici staničnog rasta
Čimbenik
struktura
učinak
receptor
____________________________________________________________________
Porodica TGF-β
TGF- β1-3
BMP 2-8
Aktivin/inhibin
Porodica TNF
TNF-α
28-30kDa
17 kDa
organizacija
mezenhima
indukcija
mezoderma
TβR-II, TβR-1
BMPR-II, ActR-1
ActR-II, ActR-I
mitogen
p55 TNFR
citotoksičnost
p75 TNFR
angiogeneza
apoptoza
stanična athezija
____________________________________________________________________
Tumor
EGFR ekspresija
Dojka
Kolon
Plućni karcinom
(ne malih stanica)
14 % - 91 %
25 % - 77 %
40 % - 80 %
Glava i vrat
80 % - 95 %
Ovarian
35 % - 70 %
Gušterača
30 % - 50 %
Percentage of Human Tumors Overexpressing EGFR
Tumor type
Percentage of tumors
Bladder
31-48
Breast
14-91
Cervix/uterus
90
Colon
25-77
Esophageal
43-89
Gastric
4-33
Glioma
40-63
Head and neck
80-100
Ovarian
35-70
Pancreatic
30-89
Renal cell
50-90
Non-small-cell-lung
40-80
Obitelj receptora epidermalnog čimbenika rasta u ljudi
EGF, TGFa , b Cellulin
Amphiregulin, HB-EGF
No specific
ligands often acts as
dimer partner
TK
TK
erbB1
HER1
EGFR
erbB2
HER2
neu
Heregulins
NRG2
NRG3
Heregulins
β-cellulin
TK
erbB3
HER3
erbB4
HER4
EGFR struktura
Izvanstanična
domena
Transmembranska
domena
TK
Unutarstanična
domena
EGF receptor




EGF receptor-funkcionira kao tirozin kinaza
 Citoplazmatska domena ima slijed sličan src proteinu,
sugerira da EGF djeluje kao tirozin kinaza
Promjena EGF može funkcionirati kao onkoprotein
 EGFsadrži slijed kao onkoprotein koji kodira erbB
onkogen od (AEV virusa, avian erythroblastosis virus )
Onkogeni transmembranski receptor neovisan o ligandu
(točkasta mutacija ili truncation-isjecanje, skraćenje)
Fuzioniranje gena uzrokuje konstitutivnu dimerizaciju
receptora-ligand neovisnu
EGFR Stimulation & dimerisation
TK
TK
TK
TK
EGFR Homo dimerizacija
erbB1
HER1
EGFR
erbB2
HER2
neu
erbB3
HER3
erbB4
HER4
EGFR stimulation cont…
TK
TK
Hetero Dimerizacija
erbB1
erbB2
HER1
HER2
EGFR
neu
Rizik za rak
TK
erbB3
HER3
erbB4
HER4
EGFR- Funkcija u normalnim stanicama
ATP
TK
TK
ATP
+
Genska transkripcija
Stanična proliferacija
Progresija staničnog
ciklusa
Angiogeneneza
Antiapoptoza
EGFR signalni prijenos u stanicama tumora
TK
TK
PI3-K
pY
pY
GRB2
pY
SOS
RAS RAF
STAT3
PTEN
AKT
MEK
Genska transkripcija
G1
M
Proliferacijko/
sazrijevanje
kemoterapija /
radioterapija
rezistancija
MAPK
S
G2
Angiogeneza
Preživljavanje
(anti-apoptoza)
Metastaze
Steroidni
hormon
Drugi mehanizmi stimulacije EGFR
MMP
HB-EGF
+
Heparin-binding EGF-like
growth factor (HB-EGF)
α
P
γ β G protein
+
Ca++
Pyk2
P
+
Ras
Src
MAPK
Transcription
erbB Ligand
Gene
Steroid
hormone
receptor
Kako se EGFR varianta razlikuje od divljeg tipa
EGFR - Varianta III
EGFR –divlji tip
Nema izvanstanične domene
nazočna
Ligand ne može vezati
Može vezati
TK konstitutivno aktivna
TK aktivirana vezanjem liganda
Ne može stvarati dimere
može stvarati dimere
Nije nazočna u normalnim
stanicama
nazočna u normalnim
stanicama
Prekomjerna ekspresija vodi
raku
Veća sklonost za rak
ATP
TK
Genska transkripcija
Progresija staničnog ciklusa
Stanična proliferacija
Metastaze
Anti Apoptosis
Rak
Mutacija
Posljedica proliferacije
EGFR receptora
Normalna stanica
Poremećaj
regulacije
Stanica raka
EGFR-dobar cilj za karcinom
pluća

Visoka razina ekspresije receptora u
usporedbi sa zdravim tkivom.
EGFR - ključnu ulogu u rastu i funkcije
tumorskih stanica.
EGFR inhibicija može spriječiti nizvodno
aktivnosti.
EGFR inhibitori nemaju tešku toksičnost.
Obrazloženje za inhibitore EGFR u
karcinomu glave i vrta




EGFR izražen u > 90% slučajeva raka glave i
vrata.
Prekomjerna ekspresija EGFR povezana sa
smanjenim preživljavanjem.
povećanje EGFR je rani događaj u
karcinogenezi i prisutan je još u premalignim
lezijama.
Inhibicija EGFR - TK usporava rast tumorskih
ksenograft modela glave i vrata.
Anti-ligand
EGFR tyrosine
Anti-EGFR mAbs mAbs
kinase inhibitors
ATP
TK
-
TK
TK
-
-
Bispecific
Abs
TK
-
Immune effector cell
Strategija inhibicije EGFR signalizacije
Dostupni lijekovi
Gefitinib
Erlotinib
Visoko selektivan, potentni i reverzibilan
EGFR tirozin kinaze inhibitor
Cetuximab – Monoklonalna Anti EGFR protutijela
H 447
MDX 210
Bispecifična Anti EGFR protutijela
Povezana sa anti CD 64
Indikacije
Gefitinib & Erlotinib:
Monoterapija u uznapredovalom stadiju NSCLC
Cetuximab
Metastatski rak debelog crijeva s / bez irinotekana
Doze
Gefitinib 250 mg O.D. oral
Erlotinib 150 mg O.D. oral
Cetuximab 400 mg/ m2 i.v.→ 200 mg / m2 i.v. wkly
Popratni učinci
osip kože
Proljev (EGFR - TKI s)
Groznica (EGFR - mAb)
Intersticijska bolest pluća - 1% (samo za gefitinib)
Prekidi zbog nuspojava su vrlo niski za razliku od
kemoterapije
Međureakcija lijeka
EGFR - TK inhibitori metaboliziraju se preko
CYP3A4.
Inhibitori / induktori CYP3A4 mogu promijeniti
razinu lijeka.
Varfarin interakcije su se dogodile u kliničkim
ispitivanjima s gefitinib.
Istovremena primjena s varfarinom zahtijeva
praćenje PV, INR.
Prednosti inhibitora EGFR
oralno učinkoviti
Bolja kvaliteta života.
Može se koristiti kao monoterapija.
Nema potrebe za premedikacijama ili praćenja
doze.
Nema hematološke toksičnosti.
Potencijal za dugotrajno liječenje.
Smanjena otpornost na zračenje ili hormonsku
terapiju
Molekularne značajke raka
Mutacije u
molekularnim
signalnim
putovima
vode do:
• samodostatnosti čimbenika rasta (ligandi ili
receptori)
• Gubitak odgovor na anti-proliferativne signale
• Izbjegavanje programirane smrti stanica
• Povećanje replikativnog potencijala (telomere)
• Promocija tkivne invazije i metastaziranja
• Trajna angiogeneza
• Pojačan abnormalnosti u DNA popravaku i
genomskoj nestabilnosti
Ser / Thr kinaze (AKT,
mTOR)
Onkogeni
Delecijom domene
(EGFRvIII, HER2
Lipidne kinaze (PI-3K)
Transkripcijski faktori (cmyc, statistika, c-Jun, cFOS)
Ciklini / CDKs (Ciklin D)
Regulatori stabilnosti
proteina (MDM2)
Antiapoptotski faktori
(bcl-2, bcl-XL)
Onkogenu funkciju
dobivaju
Mutacije onkogena su
„pokretač" nastanka tumora
Receptor / citoplazmatski
tirozin-kinaze (EGFR,
PDGFR, Ras / MAPK)
Točka mutacija (ras)
Translokacija (BCRABL, Myc)
Izmijenjena
substaničnog položaja
(BCR-ABL)
Genska amplifikacija
(Myc, EGFR, Her2)
Onkogene mutacije u karcinomu
H-Ras K-Ras
N-Ras Neu
EGFR
Increased expression
Myc
K-Ras
Myb
RelA
EGFR
int-1
int-2
mos
Altered protein
Amplification
Point mutation
Insertion
Protooncogene
Translocation
Deletion
Normal
protein
Altered Protein
Abl, Trk
Increased expression
C-Myc, Bcl-2
Altered protein
EGFR, (ERB-B1), NF-B
Philadelphia Chromosome
Bcr (160KDa)
(Breakpoint cluster region)
OLI
Abl (140KDa)
Bcr-Abl
ALL (190KDa)
CML (210KDa/230 KDa)
OLI
Nowell and Hungerford (1960)
t(9;22)(q34;q11)
CML - 95%
ALL, 25-30% in adult and 2-10% in pediatrics
Abnormal signaling and localization
JAK1/2
Crk-L
Grb2
PI-3 kinase
Sos
Akt
STAT3
STAT5
Ras
ERK1/2
Cyclin D1,D2,D3
Bcl-xL
Imatinib/Gleevec/STI571
Dasatinib
Druker, Sawyers i Talpaz pokazali da Gleevec inhibira
proliferaciju CML
Inhibiraju Abl vezanjem na ATP-vezno mjesto u
domeni kinaza
Recidiv kao rezultat leukemijskih subklonova s
rezistentnim BCR-ABL mutacijama - tretiranje sa
dasatinib
Dasatinib je oralni lijek, inhibitor
BCR / ABL i src tirozin kinaze
obitelji kod kronične mijeloične
leukemije (CML) i Philadelphia
kromosoma-pozitivni akutne
limfoblastične leukemije (Ph +
ALL) a procjenjuje se za upotrebu
u brojnim drugim vrstama raka,
uključujući i uznapredovali rak
prostate.
Myc-inducirana onkogeneza
1
MB I
MB II
143
355 366
Myc
407 413
HLH
Transactivation Domains
LZ
DNA Binding and oligomerization
1
MB= Myc Boxes
BR= Basic Region
HLH= Helix-Loop-Helix
LZ= Leucine Zipper
434
Max
151
HLH
LZ
Mehanizmi onkogene aktivacije
• 70% karcinoma ima promjene u Myc
• Kromosomske translokacije -povećavaju c-myc transkripciju
(Burkittov limfom, mišji plazmocitom i drugi limfoidnih malignih
bolesti)
• Amplifikacije gena (AML, pluća, dojke, debelog crijeva, mozga,
prostate)
• Točkaste mutacije povećanje transaktivacije funkcije (karcinom
dojke, jajnika, debelog crijeva)
• Aktivacija virusnim promotorom -B stanični limfom ptica-inducirani
ptičjim leukemogenim virusom (engl.Avian leukemia virus, ALV)
C-myc Translocations in Cancer
C-Myc
gene
,l,m loci
P1
P2
t(8;14)
J Ei
P1
Cm
Ca1
P2
t(2;8)
MAREi C
Translocation
P1
P2
t(8;22)
Cl
El
• Translokacije gen c-myc u području transkripcijski aktivne DNA
• To povećava c-myc ekspresijsku razinu i uzrokuje neprirodnu proliferaciju
Za razliku bcr-abl, c-myc translokacije ne mijenjaju strukturu proteina; povećava razinu
ekspresije gena i proteina WT
C-Myc translokacije i bolesti
Translocation
Genes
Disease
t(8;14)(q24;q32)
c-myc/IgH
Burkitt’s lymphoma
t(2;8)(p12;q24)
Ig/c-myc
Burkitt’s lymphoma
t(8;22)(q24;q11)
c-myc/Igl
Burkitt’s lymphoma
t(8;14)(q24;q32)
c-myc/IgH
Diffuse large cell lymphoma
t(8;14)(q24;q11)
c-myc/TCRa,b
t(8;14)(q24;q32)
c-myc/IgH
Multiple myeloma
t(2;8)(p12;q24)
Ig/c-myc
Multiple myeloma
t(8;22)(q24;q11)
c-myc/Igl
Multiple myeloma
T-cell acute lymphoblastic leukemia
Ras Oncogenic Mutations
EGFR
sos
Grb2
GDP
P
Tethers Ras to
membrane
P
Farnesyl
sos
GTP
x
P
Transferase
Ras
Raf-1
MEK
ERK1
1
32
GTP binding
ED
GTP binding
GTPase
192
Inhibitors
HVR
ERK1 ERK2
MEK
ERK2
G12V
•
•
•
•
Src
40
Q61L
CAAX Box
(prenylation)
Jedan od najčešće mutiranih gena
G12V i Q61L su uključeni u GTP vezivanje
Obadvije mutacije stabiliziraju GTP-vezu stvarajući Ras
Oboje resultira u konstitutivnoj aktivaciji MAPK signala
Ras Mutations in Human Tumors
Cancer or site of tumor
*K=Kirsten; H=Harvey; N=neuroblastoma
Mutation
frequency %
Non-small-cell lung cancer (adenocarcinoma)33
Colorectal
44
Pancreas
90
Thyroid
53
Follicular
60
Undifferentiated papillary
0
Papillary
43
Seminoma
13
Melanoma
10
Bladder
30
Liver
10
Kidney
40
Myelodyplastic syndrome
Acute myelogenous leukemia
30
Predominant
Ras isoform*
K
K
K
H,K,N
H,K,N
K,N
N
H
N
H
N,K
N
Tumor supresor geni
Tumor
supresorski geni su "kočnice" koji štite stanice od
karcinogeneze -A.G. Knudson prvi dao pretpostavke za
Retinoblastoma (Rb) koji loss of both alleles is required for
loss of function. This is true for most but not all Ts genes.
• nasljedan
-Maksimum 6 mjeseci
starosti
-Oba oka
-heterozigotna +/-Drugi rak 36%
kumulativnog rizika na 50
god starosti
• Ne-nasljedan
-Maksimumima na 2 godine
- Jedno oko pogođen
-homozigot + / +
-Drugi rak 6%
kumulativnog rizika na 50
god starosti
Fosfataze (npr. PTEN)
Faktori transkripcije /
represori (p53)
Popravak gena
(BRCA1 / 2, MSH)
Inhibitori staničnog
ciklusa (Rb)
Regulatori stabilnosti
proteina (c-CBL)
Induktore apoptoze
(Bax, Bad)
Gubitaak funkcije vodi
Gubitak funkcije mutacijama
uključuje gene koji kodiraju:
Tumor supresor geni
Nedostatak u zastoju
staničnog ciklusa
smanjenju apoptoze
povećanju metastaza
PTEN tumor supresor gen
Genske mutacije
Glioblastoma
Gastric
Melanoma
NHL
Breast
Prostate
Endometrium
Ovary
Lung
Bladder
25-75%
28%
20-30%
10%
15%
30%
40-80%
5%
22%
Genska metilacija
Glioblastoma
Colorectal
Invasive Breast
Melanoma
Thyroid
Endometrium
Prostate
35%
8%
48%
62%
50%
20%
50%
10%
PTEN mutacije su povezane:
• Rak (npr COWDEN sindrom), invazivnost, metastaze
• otpornost na Herceptina, vinkristin, adriamicin, 5-fluourouracil cisplatina
PTEN

PTEN protein je fosfataza koja djeluje na
fosfatidilinozitol 3,4,5 trifosfat (PIP3), ključnu
komponenta
kontrole
rasta
koja
stimulira
proliferaciju a suprimira apoptozu; PTEN negativno
regulira unutarstaničnu razinu fosfatidilinozitol3,4,5-trifosfata u stanici i djeluje kao tumor supresor
negativno regulirajući AKT / PKB signalni put.

Prekomjerna ekspresija PTEN inhibira staničnu
migraciju, širenje, fokalnu adheziju.
Glucose
Amino acids
EGFR
GLUT1
Mutant Ras
sos
Grb2
GDP
P
PIP2
P
P
P
SH2
P
PI-3K
SH2
P110
x
Glucose
PH
P
Akt
PTEN
PKA
Glucose-6-P
sos
GTP
PIP3
SH3
Ras
PIP2
PIP3
LKB1
Glycolysis
Raf-1
Src
AMPK
MEK
ERK1
ERK2
MAPK/ERK signaling
P
P
P
MDM2
NF-kB
BAD
P
FKHD
P
P
GSK3b
mTOR
p27
FasL
p53
SH2
SH3
PH
binds phosphotyrosine residues
binds proline-rich sequences
binds lipid ligands (products of PI-3K)
cell death/survival
cell cycle arrest/progression
DNA repair/misrepair
cell metabolism
rapamycin
Retinoblastoma Gene Mutations in Cancer
Retinoblastoma
70%
Small Cell Lung Carcinoma
80%
Non-Small Cell Lung Carcinoma 20-30%
Osteosarcoma
>50%
Multiple Myeloma
30%
Mitogens
Sherr (2000)
Cancer Research
60:3689-3695
Cyclin D
CDK 4/6
Rb P
P
P
E2F
Rb
S phase
entry
+
E2F
CDK 2
Cyclin E
E2F
Cyclin E
Cyclin E gene
TP53 (p53)







Transkripcjski faktor koji se veže na DNA DSBs
Degradiran vezivanjem mdm2
Mutatiran u >50% karcinoma ljudi u DNA veznoj domeni
Aktivira se preko IR kroz ATM, DNA-PK, etc.
povećanje p21 (zastoj staničnog ciklusa) i Bax (apoptoza) ekspresije
TP53 -/- miševi su osjetljivi na oštećenja DNA i imaju visoku pojavnost tumora
TP53 mutirani tumori su više agresivni i više radiorezistentni
P53 protein
1
50
TAD
MDM2
Ser33
Ser15
ATM
Ser20
ATR
ATM
ATR
Chk1
Chk2
102
292
323
DNA binding
363
356
TET
393
CTR
Ser376
Ser37
DNA-PK
ATR
Ser392
Phosphorylation sites
Decreased MDM2 binding
Increased
transcriptional activation
1
108
p53 binding
I
MDM2
nls
237
260 289
II
333
Ser395
III
IV
ATM
(inhibition of p53 nuclear export)
489
Više mutacija potrebno za onkogenezu




Prijenos jednog onkogen na normalne stanice obično
nije dovoljna da ga preobrazi
Gubitak jednog alela TS gena nedovoljan
Rak učestalost raste s dobi, što ukazuje da je
transformaciju stanica zahtijeva nakupljanje višestrukih
mutacija
Većina onkogena mogu izazvati i rast i apoptozu, što
ukazuje da je transformacija zahtijeva jednu mutaciju
koja povećava rast stanica, a drugi da inhibira staničnu
smrt (onkogen "suradnje").

Primjeri "dva hit" gena parova u tumorima:
Ras / P16 BRCA1 / p53 p27 / RB Myc / P53 Myc / Ras
Onkogena kooperacija
(valjanost "dva pogotka" hipoteze)
Ekspresija samo c-myc ili ras nedostatna za transformaciju stanice
C-myc
Ras
P16
P19 Arf
p53
Apoptosis
Senescence
Transformed focus
Ekspresija c-myc i ras zajedno vodi transformaciji
A Multi-step Process in Colorectal Cancer
Normal
Epithelium
APC(adenomatous polyposis coli)/b-catenin
Small
Adenoma
Increasing
Genetic
Instability
K-Ras/BRAF
Large
Adenoma
SMAD4/TGF-bRII
PI3K3CA/PTEN
TP53/BAX
Carcinoma
?
Metastasis
Mmultiformni glioblastom
Normal
loss of 17p, TP53;
PDGF-aR overexpression
Grade II
Loss of RB, 18q, 9p/IFN/p16;
CDK4, MDM2 amplification
Grade III
EGFR amplification/mutation
PDGF-a/b overexpression,
loss of PTEN phosphatase on chr. 10
Grade IV GBM
• Oko 40% glioblastoma pokazuju amplifikaciju genskog lokusa EGFR i oko
polovine eksprimiraju mutantni EGFRvIII receptor koji je konstitutivno aktivan
zbog skraćivanja izvanstanične ligand-vezujuće domene.
EGFRvIII povećava rezistenciju na zračenje
15-20% glioblastoma pacijenata reagira na niskomolekularne inhibitore EGFR
kinaza, ali samo ako su netaknute PTEN fosfataze.
Inihibicija aktivnosti mTOR rapamicinom pomaže..
CIKLINI I KINAZE OVISNE O
CIKLINIMA- skupine dioboupravnih
bjelančevina
Ciklini i kinaze ovisne o ciklinimaskupine dioboupravnih bjelančevina

Ciklini i kinaze ovisne o ciklinima (engl.
Cvcline Dependent Kinase, CDK) su važne
skupine dioboupravnih bjelančevina čiji
izražaj i trenutna koncentracija upravlja
umnažanjem DNA i diobom stanice.

CDK su molekule relativne molekulske
mase 35-40 kD, ciklini oko 60 kD
Regulacija staničnog ciklusa
Trajanje staničnog ciklusa
Sat koji određuje vrijeme
trajanja staničnog ciklusa
Svaka faza se događa samo
jednom i mora biti završena
do kraja
Susstav mora biti
prilagodljiv
Zaustavljanje staničnog ciklusa
-ako predhodna faza nije
dovršena
-zbog oštećenja DNA ili
-signala iz okoline
KONTROLA STANIČNOG CIKLUSA
G2/M kontrolna
M kontrolna
točka
točka
M
G2
G1
S
G1/S kontrolna
točka
G0

Kontrolne
Kontrolne točke
Ciklin ovisne kinaze i ciklini
Ciklini
Proteini odgovorni
za redosljed
pojedinih faza
staničnog ciklusa
Osiguravaju da se
svaka faza dogodi
samo jednom
Imaju kinaznu
aktivnost samo u
kompleksu s
ciklinima
Cdk (engl. cyclin depedent kinases)
Imaju kinaznu aktivnost
samo u kompleksu s
ciklinima
Fosforilraju
(aktiviraju/inaktiviraju)
ciljne proteine na serinu i
treoninu što rezultira
pokretanjem određene
faze staničnog ciklusa
Koncentracija u stanici
konstantna ali se
periodično mjenja tijekom
staničnog ciklusa
Kontrolni sustav staničnog ciklusaproteinske kinaze ovisne o ciklinima i
ciklini
Proteinske kinaze ovisne o ciklinima




Fosforilliraju ciljne proteine na
serinu i treoninu

Ciklini vežu se za Cdk
molekule i kontroliraju
njihovu sposobnost da
fosfoliraju ciljne proteine
Tijekom staničnog ciklusa
ciklički se sintetiziraju i
degradiraju
Postoje:
G1 ciklini
i mitotički ciklini
Maturacijski promocijski faktor (MPF)
–faktor poticanja sazrijevanja



Kontrolira točku G2; regulira
ulazak stanice u mitozu
Kompleks mitotičkog ciklina i
Cdk molekule
Aktivirani MPF potiče:




Kondezaciju kromosoma
Raspad jezgrine ovojnice
Reorganizaciju mikrotubula u
diobeno vreteno
Za završetak mitotičke diobe
potrebne fosfataze (uklanjaju
fosforilizirana mjesta)
Srž staničnog kontrolnog sustava


Cdk se vezuju s
različitim
ciklinima
kako bi
pokrenuli
napredovanje
staničnog ciklusa
Aktivnost Cdk prestaje
degradacijom ciklina
Ključni procesi koji potiču
napredovanje staničnog ciklusa
Cikličko nastajanje
ciklina i Cdk, aktivacija,
razgradnja kompleksa
ciklina i Cdk
Fosforilizacija ciljnih
prfoteina
Aktivacija i inaktivacija ciklina

Fizičkim vezivanjem ciklina i CDK molekulski sklop stječe enzimsku
aktivnost, a disocijacijom sklopa CDK postaje inaktivna.

inhibitorne molekule CDK - ciklinskog sklopa, autofosforilacija, te
dinamika sinteze i razgradnje ciklina i CDK putem ubikvitinizacije i
proteasomske degradacije, određuju aktivnost tih dioboupravnih
sklopova u staničnom ciklusu.

Aktivne kinaze, sklopovi CDK-ciklini fosforiliraju supstrate među
kojima protein RB (pRB) predstavlja ključnu molekulsko-molekulsku
sponu prema izravnim transkripcijskim čimbenicima u jezgri.

Stanični mehanizmi su ugođeni na neprestanu
citoplazmatski čimbenici mogu modificirati ciklus
diobu
a
aktivni Rb
neaktivni fosforilirani Rb
P
P
neaktivni
E2F
ciljni gen
Go
aktivni
E2F
transkripcija
ciljni gen
STANICA U DIOBI
Mutacija proteina RB, nema regulacije prelaza stanice iz G1 u S fazu (Retinoblastom)
pRB

pRB je bjelančevina relativne molekulske mase 105 kD čiji gen je kod
čovjeka smješten na 13q kromosomu.

U nefosforiliranom obliku pRB molekula čvrsto veže E2F transkripcijski
čimbenik zbog čega on nedostaje u DNA-vezivnim transkripcijskim
sklopovima.

E2F prijepisni čimbenik se pojavljuje kod čovjeka kao skupina molekula
E2F1, E2F2, E2F3, E2F4 i E2F5 koje djeluju u obliku heterodimera s
partnerskom molekulom DP 1.

Vezno mjesto E2F molekule za pRB čine 18 aminokiselina na karboksi
kraju proteina.

S druge strane, E2F prijepisni čimbenici izravno se vežu na DNA i to na
specifični oktanukleotidni slijed TTTCGCGC, odnosno konsenzualni slijed.
Regulatorne molekule



Regulatorne molekule pl5, pl6, p21, p27, p53,
pl07, pl30 i RB potencijalna su mjesta poremećaja
regulacije staničnog diobenog ciklusa.
Odsutnost molekula, patogenetski povoljne
mutacije ili kemijska modifikacija tih molekula
kočenja rezultira otkočenjem staničnog ciklusa i
pojavom nekontrolirane diobe.
molekulske promjene koje utječu na izražaj i
funkciju ovih regulacijskih sklopova mogu otkočiti
sustav i dovesti do nekontrolirane diobe
Geni koji su uključeni u dioboupravne procese stanice
sadrže jedan ili više oktanukleotidnih konsenzualnih
slijedova za vezno mjesto E2F*
Shematski prikaz približnih vremena utjecaja pojedinih dioboupravnihmolekula u
staničnom diobenom ciklusu. Gl/S i G2/M nadzorne točke (označene uspravnim
isprekidanim linijama) su kritične dobe staničnog ciklusa na kojima se ciklus
zaustavlja pri pojačanju signala kočenja.
Pri otkočenju
molekulski signali
pobude nesmetano
i spontano vode
stanični ciklus kroz
diobe:
Cl:CDK=cycline
dependent kinase,
kinaza ovisna o
ciklinima, to jest
kinaza kojoj je
fizičko vezivanje
ciklina neophodan
preduvjet za
funkcioniranje.)

Shematski
prikaz
molekulskih putova koji
određuju
aktivnost
staničnog ciklusa. Proteini
pl5, pl6, p21 i p27 su
inhibitori
CDK-ciklinskih
kinaznih kompleksa, čime
se smanjeno fosforilira RB
i pojačano veže E2F što
koči
stanični
ciklus.
Proteini pl07 i pl30 izravno
koče E2F i stanični ciklus.
Simbol "(—)" označava
kočenje, a simbol "(+)"
pobudu
čimbenika
iza
strelice čimbenikom ispred
strelice.
Simbol
"(+P)"
označava
fosforilaciju
čimbenika iza strelice.
Proteini pl5, pl6, p21 i p27 su inhibitori CDK-ciklinskih kinaznih kompleksa,
čime se smanjeno fosforilira RB i pojačano veže E2F što koči stanični ciklus.
UČINAK NA DIOBENI STATUS STANICE
REZULTAT JE ODNOSA FOSFORILIRANOG I
DEFOSFORILIRANOG RB-PROTEINA:

POBUDA: Hiperfosforiliranjem RB smanjuje se
nefosforilirani RB čime se oslobađa E2F, koji
oblikuje s drugim jezgrinim čimbenicima ključne
DNA-vezivne sklopove što pokreće diobu.

KOČENJE: Smanjenom fosforilacijom RB
povećava se vezivanje E2F, što uzrokuje
prestanak diobe, budući da se raspadaju ključni
DNA vezivni polimerni sklopovi.
Ciklin D–CDK4, ciklin D–
CDK6, i ciklin E–CDK2
reguliraju prijelaz G1-do-S
faze pomoću fosforilacije
RB proteina (pRB).
Ciklin A–CDK2 i ciklin A–
CDK1 su aktivni u S fazi.
Ciklin B–CDK1 je bitan za
G2-do-M prijelaz.
Dvije familije CDKIs mogu
blokirati aktivnost CDKs i
progresiju tkroz stanični
ciklus. INK4 inhibitori (p16,
p15, p18, i p19) djeluju na
c ciklin D–CDK6. Drugi
(p21, p27, i p57) mogu
inhibirati sve CDKs.
Protoonkogeni
Tumorsupresor geni
Mutacije
onkogeni
Gubitak
obadva alela
Onkogeni proteini
Protein kinaze
Ciklini
Stanični ciklus
G1 - S faza
TP53
Oštećenje DNA
zaustavlja stanični
ciklus
p53
WAF1
-P53 aktivira transkripciju
M
G2
p21
G1
S
p21 (inhibitor CdK-4-ciklin D),
aktivira gene uključene u
popravak i pokreće apoptozu
-mutacija p53, vodi nagomilavanju
muacija (genske i kromosomske)
i nastanku tumora
p21 inhibira ciklin/ciklinovisne kinaze