Transcript Metody badań toksyczności substancji chemicznych Ustalanie ADI

Metody badań toksyczności
substancji chemicznych
Ustalanie ADI, badania epidemiologiczne
Toksykologia żywności
Przedmiotem badań i oceny
toksykologicznej są:
 substancje naturalnie występujące w
żywności
 substancje stanowiące zanieczyszczenia
żywności
 substancje lub ich mieszaniny
dodawane do żywności w określonym
celu (dodatki do żywności)
Badania toksykologiczne
Dotyczą zazwyczaj działania określonego
związku, rzadziej mieszaniny substancji
znanych i bardzo rzadko mieszaniny o
nieznanym składzie
 Badania wykonuje się na kilku gatunkach
zwierząt

Zwierzęta doświadczalne
Są to najczęściej:
 Myszy białe
 Szczury białe
 Chomiki
 Świnki morskie
 Króliki
 Psy
Do oceny działania mutagennego
 Używa się bakterii i drożdży
Badania toksykologiczneznaczenie paszy
Dieta syntetyczna o stałym składzie
 Dieta półsyntetyczna – składająca się
tylko częściowo z czystych związków
chemicznych (węglowodany,
aminokwasy, witaminy, składniki
mineralne) oraz z oczyszczonych
składników naturalnych (skrobia, cukier,
kazeina)

Podawanie paszy i wody
Najczęściej stosuje się podawanie
paszy i wody ad libitum z jednoczesną
kontrolą spożycia
 Substancje badane podaje się w paszy,
zgłębnikiem dożołądkowo (rzadko) lub
w wodzie do picia
 Przy badaniu wpływu metali na
organizm woda powinna być
dejonizowana

Badaniom powinny podlegać
Związki pochodzenia naturalnego lub ich
mieszaniny
 Związki otrzymane na drodze syntezy
chemicznej lub ich mieszaniny
 Związki lub ich mieszaniny otrzymane na
drodze syntezy biologicznej, np.
preparaty enzymatyczne
 Nowe środki spożywcze lub preparaty,
np. białkowe, tłuszczowe, ich substytuty
dodawane do żywności

Zakres badań toksykologicznych
Toksyczność ostra, podostra i przewlekła
 Działanie rakotwórcze
 Działanie mutagenne
 Działanie teratogenne i embriotoksyczne
 Wpływ na płodność i rozrodczość
 Metabolizm
 Synergizm i antagonizm
 Działanie drażniące oka i skóry
 Działanie alergiczne

Zasady badań toksykologicznych

Do doświadczeń używa się zwierząt
zdrowych, znanego szczepu i ze znanej
hodowli; są to zwierzęta obu płci, młode,
karmione bez ograniczeń paszą
pełnowartościową zapewniającą
prawidłowy wzrost i rozmnażanie
Toksyczność ostra
To działanie toksyczne wywołane
podaniem badanej substancji w dawce
pojedynczej lub w kilku dawkach w
ciągu 24 h
 Jej jednostką jest medialna DL50
wyrażona w mg/kg m. c. zwierzęcia

Toksyczność ostra
Jej badanie przeprowadza się
przynajmniej na 3 gatunkach zwierząt,
młodych, o zbliżonej masie ciała np.
szczury ok. 200g
 Substancję podaje się per os w kilku
różnych dawkach, obserwuje się
zwierzęta przez określony czas
(co najmniej 14 dni) i liczy zwierzęta,
które padły w każdej grupie

Toksyczność ostra
Obserwacje powinny obejmować:
początek wystąpienia, charakter i czas
trwania objawów toksycznych
 Powinny dotyczyć: ośrodkowego i
obwodowego układu nerwowego,
oddechowego, sercowo-naczyniowego,
pokarmowego, moczowo-płciowego,
wyglądu skóry, błon śluzowych i oczu

Toksyczność ostra
Kilka dni przed podaniem badanej
substancji i do czasu zakończenia
obserwacji kontroluje się masę ciała
początkową i końcową oraz spożycie
paszy
 Wykonuje się sekcję zwierząt padłych i
uśpionych po zakończeniu doświadczenia
oraz badania makro- i mikroskopowe
narządów

Toksyczność podprzewlekła
Jej badanie wykonuje się na 2 gatunkach
zwierząt (1 to najczęściej szczury, a drugi
nie powinien być gryzoniem)
 Czas trwania doświadczenia wynosi
zwykle ok. 1/10 normalnego okresu życia
zwierząt (szczury, myszy – 90 dni, świnie
– 1 rok)
 Używa się młodych zwierząt (np. szczury
4-5 tyg. o masie ok. 50-60 g)

Toksyczność podprzewlekła
Badaną substancję podaje się w
paszy w 3-4 różnych dawkach
 Dawki powinny być tak dobrane aby
jedna stanowiła poziom NOAEL a
druga LOAEL
 Wielkość dawek ustala się w
badaniach pilotażowych trwających
ok. 4 tyg.

Toksyczność podprzewlekła
Zakres badań obejmuje
Badania ogólne:
 wygląd i ogólny stan zdrowia,
zachowanie zwierząt
 śmiertelność (ustalenie przyczyn)
 codzienne spożycie paszy i wody
 przyrost masy ciała
Toksyczność podprzewlekła
Badania hematologiczne:
 hematokryt
 zawartość hemoglobiny
 liczba krwinek czerwonych, białych i
płytek krwi
 czas protrombinowy
Toksyczność podprzewlekła
Badania biochemiczne:
 W surowicy: m.in. białko, glukozę, azot
mocznikowy, TG, cholesterol, elektrolity,
enzymy- ALAT, ASPAT, AP
 W wątrobie: białko, enzymy- ALAT,
ASPAT, AP i wiele innych
Badanie moczu oraz badania
hematologiczne i biochemiczne wykonuje
się po 2, 4 i 12 tyg. równolegle w grupach
badanych i kontrolnych
Toksyczność podprzewlekła
Badanie oczu – na początku i na końcu
 Sekcja zwierząt padłych i uśpionych po
zakończeniu doświadczenia – należy
zważyć wszystkie narządy i wykonać
 Badanie histopatologiczne – co
najmniej 20-22 narządów i tkanek

Toksyczność przewlekła
Dobór zwierząt jak w toksyczności
podostrej
 Czas trwania doświadczenia –
praktycznie cały okres życia
zwierząt, np. dla szczurów – ok. 2
lata, myszy – 1,5 roku, świń – 5-7 lat

Toksyczność przewlekła
Substancję badaną podaje się w
paszy w różnych dawkach ustalonych
wcześniej w badaniach toksyczności
podprzewlekłej, tak aby można było
wyznaczyć poziomy:
 NOAEL i LOAEL

Toksyczność przewlekła
Obserwacje zwierząt, badania krwi,
wątroby i moczu – tak jak w badaniu
toksyczności podostrej
 po 6, 12, 18 i 24 miesiącach (dla gryzoni)
 Badania histopatologiczne – w zależności
od wyników badań toksyczności
podostrej mogą być poszerzone o inne
narządy (aortę, oko, język, grasicę,
ślinianki i inne)

Badanie rakotwórczości

Zwierzęta: myszy i szczury młode,
jak w teście podprzewlekłym,
pochodzące od rodziców
otrzymujących przez ok. 2 miesiące
przed kojarzeniem paszę z
dodatkiem badanej substancji w
odpowiednich dawkach
Badanie rakotwórczości
Grupy zwierząt:
 Kontrolna
 Otrzymująca dawkę maksymalną –
 Otrzymująca 1/3 dawki maksymalnej
 Otrzymująca 1/9 dawki maksymalnej
Badanie rakotwórczości
Liczba zwierząt
 100 szczurów (po 50 każdej płci) dla
każdego poziomu dawki
 100 myszy (po 50 każdej płci) dla
każdego poziomu dawki
Czas podawania substancji w paszy
 Szczury – 2 lata
 Myszy – 1,5 roku
 Psy, świnie – 5-7 lat
Badanie rakotwórczości
Obserwacje:
 Spożycie paszy, wody i masa ciała – jak w
toksyczności przewlekłej
 Stan zwierząt – każdego dnia, dzień
śmierci zwierząt padłych i jej przyczynę
na podstawie sekcji
 Na końcu – sekcja pozostałych zwierząt i
badania makroskopowe, waży się:
wątrobę, nerki, śledzionę, nadnercza,
węzły chłonne, tarczycę, jajniki, mózg,
przysadkę, jądra, płuca, pęcherz
Badanie rakotwórczości
Wykonuje się rozmaz krwi i szpiku
 Badana mikroskopowe 7 pierwszych
narządów ale bada się także te
narządy, w których obserwowano
zmiany w czasie sekcji

Badanie rakotwórczości
Interpretacja:
 Oparta jest na liczbie się guzów i
czasie ich pojawienia się w tych
samych narządach zwierząt badanych
i kontrolnych oraz czasie przeżycia
zwierząt
 Uwzględnia się guzy złośliwe i
niezłośliwe
Badanie zdolności rozrodczej i
wpływu na potomstwo
Ma na celu zbadanie możliwego
wpływu badanej substancji na
płodność i laktację oraz pozwala na
zaobserwowanie zmian genetycznych
 Grupy zwierząt i dawki – jak przy
toksyczności przewlekłej

Badanie zdolności rozrodczej i
wpływu na potomstwo
Obserwacje:
 % zapłodnienia
 Okres ciąży (krótszy, dłuższy)
 Liczba młodych w każdym miocie
 Masa ciała młodych
 Śmiertelność noworodków
 Odchylenia od stanu prawidłowego w 4,
12 i 21 dniu życia
 Badania histopatologiczne narządów od
10 samic i 10 samców z każdej grupy
Badanie teratogenności
Zwierzęta:
 Szczury, chomiki, króliki (zalecane
samice po raz pierwszy zapładniane),
po 20 zwierząt dla każdej dawki
 Młode, zdrowe, dojrzałe fizycznie i
płciowo
 Badaną substancję podaje się w paszy
ciężarnym samicom w okresie
organogenezy (szczury – 6-15 dzień
ciąży, chomiki – 6-10 dzień, króliki
dzień- 6-18)
Badanie teratogenności

Dawkowanie substancji zależy od
szybkości jej wydalania z organizmu
oraz jej działania embrio- i
cytotoksycznego
Badanie teratogenności
Wymagane są co najmniej 3 poziomy
dawek, np.
 Grupa kontrolna
 Grupa otrzymująca dawkę małą –
1/250 DL50
 Grupa otrzymująca dawkę pośrednią
– 1/100 DL50
 Grupa otrzymująca dawkę dużą –
1/50 DL50
Badanie teratogenności
Obserwacje:
 Spożycie paszy i wody oraz kontrola
masy ciała w określonych dla danego
zwierzęcia dniach ciąży
 Płody wyjmuje się przez cesarskie
cięcie u szczurów na 1 dzień przed
porodem, u królików – 2 dni
Badanie teratogenności
Ocenia się:
 Liczbę płodów po prawej i lewej stronie
macicy
 Liczbę resorpcji
 Liczbę ciałek żółtych
 Masę płodów z łożyskiem i bez
 Długość płodu z ogonem, długość ogona
 Płeć
 Deformacje makroskopowe
 Deformacje szkieletu
 Liczbę krwiaków
Badanie teratogenności
U 20% samic w grupie nie wykonuje
się cesarskiego cięcia
 Płody normalnie urodzone obserwuje
się przez 2-3 miesiące aby wychwycić
wady pojawiające się w czasie
rozwoju
 Wybrane losowo zwierzęta kojarzy
się w celu otrzymania II generacji
 Młode tej generacji usypia się po 21
dniach i bada ich rozwój

Badanie mutagenności
Działanie mutagenne jest ściśle
związane z działaniem rakotwórczym
 Ok. 90% związków rakotwórczych
wykazuje działanie mutagenne w
prostych testach bakteryjnych

Badanie mutagenności
Stosuje się testy bakteryjne Amesa
 Pozwalają wykryć mutacje punktowe:
 mikrojąderkowy – umożliwia wykrycie
uszkodzeń w chromosomach
 test reperacji DNA

Badanie działania
alergicznego- kontaktowego
Testy na zwierzętach
 Badania z udziałem ludzi – testy w
klinikach dermatologicznych

Dotyczą kosmetyków i środków
piorących
Ekstrapolacja wyników badań

Biorąc pod uwagę wyniki wszystkich
badań na zwierzętach oraz ustaloną w
badaniach toksyczności przewlekłej
dawkę NOAEL – ustala się dawkę ADI
dla człowieka
ADI = NOAEL : 100 (najczęściej ale może
to być także :10 lub :1000)
Badania epidemiologiczne
Kiedy wiadomo, że zanieczyszczenie wnikające
do organizmu ma potencjalne właściwości
rakotwórcze jest możliwe:
Retrospektywne badanie epidemiologiczne
jeżeli wykaże ono zależność między ekspozycją
na czynnik rakotwórczy i zachorowalnością oraz
śmiertelnością – czynnik może zostać uznany za
rakotwórczy dla ludzi