Metody badań toksyczności substancji chemicznych Ustalanie ADI
Download
Report
Transcript Metody badań toksyczności substancji chemicznych Ustalanie ADI
Metody badań toksyczności
substancji chemicznych
Ustalanie ADI, badania epidemiologiczne
Toksykologia żywności
Przedmiotem badań i oceny
toksykologicznej są:
substancje naturalnie występujące w
żywności
substancje stanowiące zanieczyszczenia
żywności
substancje lub ich mieszaniny
dodawane do żywności w określonym
celu (dodatki do żywności)
Badania toksykologiczne
Dotyczą zazwyczaj działania określonego
związku, rzadziej mieszaniny substancji
znanych i bardzo rzadko mieszaniny o
nieznanym składzie
Badania wykonuje się na kilku gatunkach
zwierząt
Zwierzęta doświadczalne
Są to najczęściej:
Myszy białe
Szczury białe
Chomiki
Świnki morskie
Króliki
Psy
Do oceny działania mutagennego
Używa się bakterii i drożdży
Badania toksykologiczneznaczenie paszy
Dieta syntetyczna o stałym składzie
Dieta półsyntetyczna – składająca się
tylko częściowo z czystych związków
chemicznych (węglowodany,
aminokwasy, witaminy, składniki
mineralne) oraz z oczyszczonych
składników naturalnych (skrobia, cukier,
kazeina)
Podawanie paszy i wody
Najczęściej stosuje się podawanie
paszy i wody ad libitum z jednoczesną
kontrolą spożycia
Substancje badane podaje się w paszy,
zgłębnikiem dożołądkowo (rzadko) lub
w wodzie do picia
Przy badaniu wpływu metali na
organizm woda powinna być
dejonizowana
Badaniom powinny podlegać
Związki pochodzenia naturalnego lub ich
mieszaniny
Związki otrzymane na drodze syntezy
chemicznej lub ich mieszaniny
Związki lub ich mieszaniny otrzymane na
drodze syntezy biologicznej, np.
preparaty enzymatyczne
Nowe środki spożywcze lub preparaty,
np. białkowe, tłuszczowe, ich substytuty
dodawane do żywności
Zakres badań toksykologicznych
Toksyczność ostra, podostra i przewlekła
Działanie rakotwórcze
Działanie mutagenne
Działanie teratogenne i embriotoksyczne
Wpływ na płodność i rozrodczość
Metabolizm
Synergizm i antagonizm
Działanie drażniące oka i skóry
Działanie alergiczne
Zasady badań toksykologicznych
Do doświadczeń używa się zwierząt
zdrowych, znanego szczepu i ze znanej
hodowli; są to zwierzęta obu płci, młode,
karmione bez ograniczeń paszą
pełnowartościową zapewniającą
prawidłowy wzrost i rozmnażanie
Toksyczność ostra
To działanie toksyczne wywołane
podaniem badanej substancji w dawce
pojedynczej lub w kilku dawkach w
ciągu 24 h
Jej jednostką jest medialna DL50
wyrażona w mg/kg m. c. zwierzęcia
Toksyczność ostra
Jej badanie przeprowadza się
przynajmniej na 3 gatunkach zwierząt,
młodych, o zbliżonej masie ciała np.
szczury ok. 200g
Substancję podaje się per os w kilku
różnych dawkach, obserwuje się
zwierzęta przez określony czas
(co najmniej 14 dni) i liczy zwierzęta,
które padły w każdej grupie
Toksyczność ostra
Obserwacje powinny obejmować:
początek wystąpienia, charakter i czas
trwania objawów toksycznych
Powinny dotyczyć: ośrodkowego i
obwodowego układu nerwowego,
oddechowego, sercowo-naczyniowego,
pokarmowego, moczowo-płciowego,
wyglądu skóry, błon śluzowych i oczu
Toksyczność ostra
Kilka dni przed podaniem badanej
substancji i do czasu zakończenia
obserwacji kontroluje się masę ciała
początkową i końcową oraz spożycie
paszy
Wykonuje się sekcję zwierząt padłych i
uśpionych po zakończeniu doświadczenia
oraz badania makro- i mikroskopowe
narządów
Toksyczność podprzewlekła
Jej badanie wykonuje się na 2 gatunkach
zwierząt (1 to najczęściej szczury, a drugi
nie powinien być gryzoniem)
Czas trwania doświadczenia wynosi
zwykle ok. 1/10 normalnego okresu życia
zwierząt (szczury, myszy – 90 dni, świnie
– 1 rok)
Używa się młodych zwierząt (np. szczury
4-5 tyg. o masie ok. 50-60 g)
Toksyczność podprzewlekła
Badaną substancję podaje się w
paszy w 3-4 różnych dawkach
Dawki powinny być tak dobrane aby
jedna stanowiła poziom NOAEL a
druga LOAEL
Wielkość dawek ustala się w
badaniach pilotażowych trwających
ok. 4 tyg.
Toksyczność podprzewlekła
Zakres badań obejmuje
Badania ogólne:
wygląd i ogólny stan zdrowia,
zachowanie zwierząt
śmiertelność (ustalenie przyczyn)
codzienne spożycie paszy i wody
przyrost masy ciała
Toksyczność podprzewlekła
Badania hematologiczne:
hematokryt
zawartość hemoglobiny
liczba krwinek czerwonych, białych i
płytek krwi
czas protrombinowy
Toksyczność podprzewlekła
Badania biochemiczne:
W surowicy: m.in. białko, glukozę, azot
mocznikowy, TG, cholesterol, elektrolity,
enzymy- ALAT, ASPAT, AP
W wątrobie: białko, enzymy- ALAT,
ASPAT, AP i wiele innych
Badanie moczu oraz badania
hematologiczne i biochemiczne wykonuje
się po 2, 4 i 12 tyg. równolegle w grupach
badanych i kontrolnych
Toksyczność podprzewlekła
Badanie oczu – na początku i na końcu
Sekcja zwierząt padłych i uśpionych po
zakończeniu doświadczenia – należy
zważyć wszystkie narządy i wykonać
Badanie histopatologiczne – co
najmniej 20-22 narządów i tkanek
Toksyczność przewlekła
Dobór zwierząt jak w toksyczności
podostrej
Czas trwania doświadczenia –
praktycznie cały okres życia
zwierząt, np. dla szczurów – ok. 2
lata, myszy – 1,5 roku, świń – 5-7 lat
Toksyczność przewlekła
Substancję badaną podaje się w
paszy w różnych dawkach ustalonych
wcześniej w badaniach toksyczności
podprzewlekłej, tak aby można było
wyznaczyć poziomy:
NOAEL i LOAEL
Toksyczność przewlekła
Obserwacje zwierząt, badania krwi,
wątroby i moczu – tak jak w badaniu
toksyczności podostrej
po 6, 12, 18 i 24 miesiącach (dla gryzoni)
Badania histopatologiczne – w zależności
od wyników badań toksyczności
podostrej mogą być poszerzone o inne
narządy (aortę, oko, język, grasicę,
ślinianki i inne)
Badanie rakotwórczości
Zwierzęta: myszy i szczury młode,
jak w teście podprzewlekłym,
pochodzące od rodziców
otrzymujących przez ok. 2 miesiące
przed kojarzeniem paszę z
dodatkiem badanej substancji w
odpowiednich dawkach
Badanie rakotwórczości
Grupy zwierząt:
Kontrolna
Otrzymująca dawkę maksymalną –
Otrzymująca 1/3 dawki maksymalnej
Otrzymująca 1/9 dawki maksymalnej
Badanie rakotwórczości
Liczba zwierząt
100 szczurów (po 50 każdej płci) dla
każdego poziomu dawki
100 myszy (po 50 każdej płci) dla
każdego poziomu dawki
Czas podawania substancji w paszy
Szczury – 2 lata
Myszy – 1,5 roku
Psy, świnie – 5-7 lat
Badanie rakotwórczości
Obserwacje:
Spożycie paszy, wody i masa ciała – jak w
toksyczności przewlekłej
Stan zwierząt – każdego dnia, dzień
śmierci zwierząt padłych i jej przyczynę
na podstawie sekcji
Na końcu – sekcja pozostałych zwierząt i
badania makroskopowe, waży się:
wątrobę, nerki, śledzionę, nadnercza,
węzły chłonne, tarczycę, jajniki, mózg,
przysadkę, jądra, płuca, pęcherz
Badanie rakotwórczości
Wykonuje się rozmaz krwi i szpiku
Badana mikroskopowe 7 pierwszych
narządów ale bada się także te
narządy, w których obserwowano
zmiany w czasie sekcji
Badanie rakotwórczości
Interpretacja:
Oparta jest na liczbie się guzów i
czasie ich pojawienia się w tych
samych narządach zwierząt badanych
i kontrolnych oraz czasie przeżycia
zwierząt
Uwzględnia się guzy złośliwe i
niezłośliwe
Badanie zdolności rozrodczej i
wpływu na potomstwo
Ma na celu zbadanie możliwego
wpływu badanej substancji na
płodność i laktację oraz pozwala na
zaobserwowanie zmian genetycznych
Grupy zwierząt i dawki – jak przy
toksyczności przewlekłej
Badanie zdolności rozrodczej i
wpływu na potomstwo
Obserwacje:
% zapłodnienia
Okres ciąży (krótszy, dłuższy)
Liczba młodych w każdym miocie
Masa ciała młodych
Śmiertelność noworodków
Odchylenia od stanu prawidłowego w 4,
12 i 21 dniu życia
Badania histopatologiczne narządów od
10 samic i 10 samców z każdej grupy
Badanie teratogenności
Zwierzęta:
Szczury, chomiki, króliki (zalecane
samice po raz pierwszy zapładniane),
po 20 zwierząt dla każdej dawki
Młode, zdrowe, dojrzałe fizycznie i
płciowo
Badaną substancję podaje się w paszy
ciężarnym samicom w okresie
organogenezy (szczury – 6-15 dzień
ciąży, chomiki – 6-10 dzień, króliki
dzień- 6-18)
Badanie teratogenności
Dawkowanie substancji zależy od
szybkości jej wydalania z organizmu
oraz jej działania embrio- i
cytotoksycznego
Badanie teratogenności
Wymagane są co najmniej 3 poziomy
dawek, np.
Grupa kontrolna
Grupa otrzymująca dawkę małą –
1/250 DL50
Grupa otrzymująca dawkę pośrednią
– 1/100 DL50
Grupa otrzymująca dawkę dużą –
1/50 DL50
Badanie teratogenności
Obserwacje:
Spożycie paszy i wody oraz kontrola
masy ciała w określonych dla danego
zwierzęcia dniach ciąży
Płody wyjmuje się przez cesarskie
cięcie u szczurów na 1 dzień przed
porodem, u królików – 2 dni
Badanie teratogenności
Ocenia się:
Liczbę płodów po prawej i lewej stronie
macicy
Liczbę resorpcji
Liczbę ciałek żółtych
Masę płodów z łożyskiem i bez
Długość płodu z ogonem, długość ogona
Płeć
Deformacje makroskopowe
Deformacje szkieletu
Liczbę krwiaków
Badanie teratogenności
U 20% samic w grupie nie wykonuje
się cesarskiego cięcia
Płody normalnie urodzone obserwuje
się przez 2-3 miesiące aby wychwycić
wady pojawiające się w czasie
rozwoju
Wybrane losowo zwierzęta kojarzy
się w celu otrzymania II generacji
Młode tej generacji usypia się po 21
dniach i bada ich rozwój
Badanie mutagenności
Działanie mutagenne jest ściśle
związane z działaniem rakotwórczym
Ok. 90% związków rakotwórczych
wykazuje działanie mutagenne w
prostych testach bakteryjnych
Badanie mutagenności
Stosuje się testy bakteryjne Amesa
Pozwalają wykryć mutacje punktowe:
mikrojąderkowy – umożliwia wykrycie
uszkodzeń w chromosomach
test reperacji DNA
Badanie działania
alergicznego- kontaktowego
Testy na zwierzętach
Badania z udziałem ludzi – testy w
klinikach dermatologicznych
Dotyczą kosmetyków i środków
piorących
Ekstrapolacja wyników badań
Biorąc pod uwagę wyniki wszystkich
badań na zwierzętach oraz ustaloną w
badaniach toksyczności przewlekłej
dawkę NOAEL – ustala się dawkę ADI
dla człowieka
ADI = NOAEL : 100 (najczęściej ale może
to być także :10 lub :1000)
Badania epidemiologiczne
Kiedy wiadomo, że zanieczyszczenie wnikające
do organizmu ma potencjalne właściwości
rakotwórcze jest możliwe:
Retrospektywne badanie epidemiologiczne
jeżeli wykaże ono zależność między ekspozycją
na czynnik rakotwórczy i zachorowalnością oraz
śmiertelnością – czynnik może zostać uznany za
rakotwórczy dla ludzi