Transcript Egyebet nem tudok elmondani… kérem kapcsolja ki!
A funkcionális genomikában rejlő potenciálok
Lars M. Steinmetz és Ronald W. Davies cikke alapján Horvát Sándor, IV. éves biológus értelmezésében
A genomiális információ megismerésével a biológia új korszakba ért.
A funkcionális genomika eszközeivel választ kaphatunk olyan kérdésekre, mint pl.: Mikor expresszálódik egy gén?
Hol lokalizálódik a terméke?
Milyen más géntermékekkel kerül interakcióba?
-Milyen fentotípust eredményez a gén mutációja
?
A genom project különösen a ek nagy mértékben segítették a funkcionális genomika, DNS microarray (DNS chip) technológia fejlődését, elterjedését.
Az igazi genom éra akkor köszönt be, amikor elsősorban a szekvencia adatokból következtethetünk a funkcionális információra.
A génfunkció megállapításának hatékony módja a mutánsok analízise A génfunkció megváltoztatható: delécióval inszerciós mutagenezissel RNS interferenciával
Célzott deléció homológ rekombinációval
Eltávolítódik a célzott gén, így a funkcionális redukció teljes Élesztőben, egérben jól használható Újabban Drosophilában is alkalmazzák Nem működik hatékonyan C. elegansban ill. Arabidopsisban
Célzott deléció homológ rekombinációval
(molekuláris „vonalkód” tag-ek alkalmazása)
a
Minden Saccharomyces cerevisiae génhez egy deléciós kazettát szintetizáltak (deléciós pool).
A deléciós kazettát PCR-rel hozták létre.
A két végén 45 bp-nyi rész a cél gént ismeri fel.
KanMX: antibiotikum rezisztancia UPTAG, DNTAG: upstream ill. downstream egyedi felismerő rész CP (Common Priming helyek): különbözőek a kereszthibridizációt elkerülendő
c
A deléciós fenotípusok kvantitatív mérése: a szelekció során összehasonlíthatják a szignál intenzitást, ebből következtetnek a törzsek fitness-ére b A deléciós pool kompettív növekedése, genomi DNS extrakció, PCR, hibridiáció (high-density oligonucleotide array) Átfedő ORF-eknél nem jól működik (másodlagos mutációk,életképtelenség esszenciális gének homozígóta deléciójánál)
Eredmények: • Funkcionálisan releváns gének felismerése • Expresszió és funkció összehasonlítása • Drog (gyógyszer) targetek felderítése • Betegség gének meghatározása • Molekuláris evolúció tanulmányozása
Inszerciós mutagenezis
Transzpozon, vagy más inszertálódó szekvencia Random, ezért screenelés szükséges Létrejöhet teljes , inkomplett , ill.
nem funkcionális redukció az integrációtól függően Arabidopsis, Drosophila, élesztő, C. elegans, egér
Inszerciós mutagenezis
Élesztőben: transzpozonokkal mutáns fenotípusokat, génexpressziót, protein lokalizációt lehet vizsgálni -Arabidopsisban: Agrobaci T DNS alkalmazása Hátrányai: Teljes genom feltöltés nehéz, a genom egyes régiói nem alkalmasak inszercióra, intergenikus szekvenciába inzertálódásnak nincs hatása.
RNS interferencia
Legújabb technológia gén expresszió redukálásra C. elegansban fedezték fel, hogy dsRNS szekvencia specifikusan „elnémítja” a génfunkciót Rövid dupla szálú RNS könnyen előállítható Gyakran nem teljes, és a specifitás mértéke nehezen prediktálható Mégis a legtöbb modell organizmusban működik pl: féreg (dsRNS-t produkáló plazmidokat tartalmazó E. colival etetik), Drozi, növények, emlősök
Komplex jellegek genetikai feltérképezése
A genetikai térképezés sikeres volt pl. az asztma génjeinek megtalálásában Gondosan kiválasztott populációkban több ezer polimorfizmus kutatása a szekvencia variánsok gyakoriságának felderítése céljából A statisztikai predikciókhoz több marker kellene (kevés mintából, olcsón)
A genotipizálás módszerei
DNS hibridizálása microarray-hez: PCR amplifikált, vagy genomi DNS, tökéletes egyezés eseten erős hibridizáció a próbához Fluoreszcens polarizáció: PCR, a primer vége egy bázissal a polimorf régió vége előtt van, kiegészítve két különböző fluoreszcens dideoxi-nukleotiddal Tömegspektroszkópia: gyors, pontos Molekuláris „vonalkódok”: molekuláris inverziós próbának is nevezik, közvetlenül a genomi DNS en végezhető, egy reakcióval SNP-k (single nucleotide polymorph, pontmutáció) ezrei analizálhatók Egyedi DNS vonalkódot tartalmazó próba, a 2 vége komplementer a polimorf r.-t szegélyező résszel
Humán mendeli öröklődésű betegségek
Egy korábbi review szerint a több, mint 1400 ismert mendeli öröklődésű betegség gén közül: 1% nál kevesebb regulátoros változás 58% missense, vagy nonsense mutáció az ORF-ekben 30% inszerció,vagy deléció 10% splicing variáns
Polimorfizmusok felismerése mismatch-repair detektálással Polimorfizmust tartalmazó DNS szakaszok elkülönítése a nem tartalmazóktól PCR termék pool összekeverése lineáris vektor DNS-sel (metilált, 5bp
CRE
deléció) + standardok (teljes
CRE
, nem metilált) Heteroduplex képződés Heteroduplexek transzformálása E. coli törzsbe, aminek az episzómáján (genomba integrálódni képes plazmid) 2
LOX
hely (ide
CRE
rekombináz kötödik) van, köztük tetraciklin rezisztencia (
tetR
) ill. streptomycin szenzitivitás (
strS
) gének találhatók Ha a teszt fragmentben nincs polimorfizmus, nincs repair (5bp-nyi del./inszerció nem inditja el)
tetR / strS / lox
kazetta rekombinálódik, a bacik tet. szenzitívek és str. rezisztensek lesznek (a törzs str. rez.
gént tartalmaz a kromoszómáján) Ha van polimorfizmus, a javítás a
CRE
inaktív, a sejtek tet . rezisztensek, ill. str.
génre is kiterjed, így az szenzitívek maradnak.
Nagy teljesítményű fejlesztési ciklusok 1. 2. amplifikálás (PCR) 2. 3. miniatürizálás („single tube”) 4. több párhuzamos nagy teljesítményű kísérlet 5. egész genomot érintő mérések (gén expresszió, genotipizálás, knock-out analízis, protein analízis, splicing, stb.) kombinálása
QTL ek genetikai térképezése
QTL (quantitative trait loci, mennyiségi jellegek) Nem mindig praktikus minden vizsgált gén esetében komplementációs tesztet végezni Ezért élesztőben nagyon ígéretes eszköznek tűnik a reciprok hemizigócia egyedben) (diploid genotípus, de csak egy kópiában van jelen a gén, pl. X kromoszóma génjei hím Ezzel a technikával egyetlen allél hatásának meghatározásával -különben egyöntetű genetikai környezetben- felismerhető egy QTL allél A technika két diploid, heterozigóta törzs összehasonlításán alapul Alkalmas kapcsoltság megcáfolására ill. két genom allélvariánsainak analizálására egyetlen lépésben
Allél kapcsolás reciprok hemizigóciával
a Két-két heterozigóta törzs genomja 1 1 allélre nézve reciprok módon hemizigóta b Molekuláris „vonalkódok” alkalmazásával az egész genom összehasonlítható c Hibridizálás után az allélvariánsok meghatározhatók, a példában a B1 allél erősebb szignált produkál, tehát domináns a B2 felett
Konklúziók
A funkcionális genomika új távlatokat nyitott a biológiában, mindazonáltal még gyerekcipőben jár pl. a komplex genetikai reguláció, protein interakciók, és biokémiai reakciók terén A modell organizmusokon végzett vizsgálatok magasabbrendű szervezetekben is hasznosak pl. humán rendellenességek kutatásában Elterjedés a klinikumban, diagnosztikában, személyre szabott terápiában A felfedezéseket elősegítendő a nagy teljesítményű biológiának az önálló laboratóriumokban van igazán jövője Miniatürizálás, költségek csökkentése fontos Különböző kísérletek (gén expresszió, genotipizálás, knock-out analízis, protein analízis, stb.) egyesítése („single tube” elképzelés ) Mindezek megvalósításval jobb, és olcsóbb diagnosztika ill. egészségügyi ellátás (szép új jövő…:)