Transcript DNS - SzTE Biotechnológiai Tanszék

A Biotechnológiai Tanszék oktatási anyaga
az alábbi internet címen érhető el:
http://biotech.szbk.u-szeged.hu
1
2
3
Molekuláris
biológia
Mikrobiológia
Biokémia
Genetika
Sejtbiológia
Immunológia
kémiai
tudományok
Molekuláris
biotechnológia
Élelmiszer
biotechnnológia
genetikailag módosított
növények, állatok,
fermentatív termékek
Farmakológia,
drogok, vakcinák
DNS- és
immundignosztika
génterápia
Iparilag hasznos termékek
előállítása,
aminosavak, peptidek
fehérjék, metabolitok,
egyéb vegyületek
Környezetvédelem,
bioremediáció,
biodegradáció
4
A FEHÉRJÉK TÚLTERMELTETÉNEK ELŐNYEI
Fő ok:
Ha egy fehérjére nagy mennyiségben van szükség, és a természetben csak kis
mennyiségben fordul elő, vagy az eredeti sejtvonal nehezen kezelhető, belõle fehérje
csak körülményesen nyerhető.
KÖZVETLEN FELHASZNÁLÁS
IPARI,
proteázok, szénhidrátbontó enzimek, lipázok,
polimerázok,bioaktív peptidek, fehérjék, hormonok, farmakológiai, gyógyászati
felhasználásra
KUTATÁSI CÉLOKRA
biokémiai és biofizikai vizsgálati módszerek,
3 dimenziós röntgenszerkezet,
mutációs analízis,
FELTÉTEL:
A felhasználás előtt igazolni kell, hogy az eredeti fehérje és a rekombináns
megfelelője biológiailag ekvivalens
5
NUKLEINSAVAK
DNS
- genetikai információ hordozó
az élőlények összes biológiai sajátságához szükséges információ
genomi könyvtárak, genom projektek: ezen információk megfejtése
 módosítható
 genetikailag módosított élőlények (genetically modified organisms
(gmo))
 metabolikus utak befolyásolása
 rekombináns termékek előllítása
ELŐFORDULÁS
Prokarióták
Eukarióták
kromoszóma, nincs sejtmag
extrakromoszómális elemek,
plazmidok,
fágok
kromoszóma, sejtmag
mitokondrium
kloroplaszt
egyéb extrakromoszómális
elemek, plazmidok
vírusok
RNS
tRNS
transzfer RNS
aminosav szállítás
mRNS
messenger RNS
aktív transzkripció
cDNS könyvtárak
rRNS
riboszómális RNS
funkcionális genomika
6
DNA
RNA
H
3
U
OH
2
OH
OH
OH
1
7
A DNS felépítése
8
DNS-olvadáspont
Streptococcus DNS olvadási görbéje.
Tm= az a hőmérséklet ahol a 50% DNS megolvadt.
9
A DNS G-C tartalma és olvadáspontja közötti összefüggés
10
Annealing vagy Hibridizáció
Lehet
• DNS - DNS
• DNS - RNS
• RNS - RNS
11
DNS-struktúrák
“A” DNS
“B” DNS
“Z” DNS
12
A KÜLÖNBÖZŐ DNS FORMÁK TULAJDONSÁGAI
“A”
“B”
rövid, széles
“Z”
hosszabb, vékony
megnyúlt, karcsú
jobbcsavar
jobbcsavar
balcsavar
tengely
nagy árok
bázis párokon át
kis árok
nagy árok
szűk, mély
széles, közepesen mély
kis árok
nagyon széles
glikozidos kötés
előfordulás
anti
dehidratált
szűk közepesen mély
anti
természetes
felületen kisimult
nagyon szűk és mély
anti (C), szün (G)
(Pu-Py)n, magas só,
vagy metiláció esetén
Egyéb fomák: egyszálú, három szálú (Hoogsteen triplex), „D” és „E” forma (guaninok eltávolítva)
13
DNS tisztítása
kromoszomális, plazmid
1. Sejtfeltárás
- lúgos kezelés
- fagyasztás – felmelegítés
- lizozimos kezelés (baktériumok)
- hő
- nyomás, French- press
- ultrahangos szonikálás
2. Egyéb sejtalkotók eltávolítása
- lipidek, poliszaharidok:
 szelektív kicsapás a sejtfeltárás körülményei között
 szerves extrakció, fenol-kloroform elegyével
 a DNS szelektív kicsapása alkohollal
- fehérjék:
 fehérje bontó enzimek alkalmazása: proteináz K
 szerves folyadék-folyadék extrakció, fenol-kloroform
elegyével
- RNS:
 szelektív kicsapás LiCl oldattal
 RNáz enzimek alkalmazása,
14
DNS etanollal, izopropilalkohollal kicsapható
Kromoszómális DNS nagy, makroszkopikus molekula kiemelhető
Minél nagyobb egy DNS, annál könnyebben törik.
Kb. 20 kb – osnál nagyobb DNS erős fizikai behatásnak
(vortexes kevertetés) nem tehető ki!
Egyéb tisztítási módszerek
kromatográfia,
- ioncserés DEAE (dietil-aminoetil)
kötés alacsony, elúció magas sókoncentráció esetén
A DNS savas  ionos kölcsönhatás
+
hordozó
N
- szilikagél alapú elválasztás
magas sókoncentráció mellett felkötődik
a DNS, alacsony sókoncentrációnál eluálódik
15
- CsCl sűrűséggradiens centrifugálás
adott koncetrációjú CsCl oldat centrifugálás során grádienst képez,
a DNS a saját sűrűségének megfelelő helyre vándorol és ott megáll.
különböző konformációjú DNS-k szétválaszthatóak, nagy tisztaság
RNS tisztítása
RNS nagyon könnyen degradálódik, RNázok stabilak
a tisztítás során RNáz mentesíteni kell mindent
DEPC: dietil pirokarbonát
O
O
O
O
O
16
RNS tisztítása
sok eltérő protokol,
ma univerzálisan használható rendszer a guanidium isotiocianát-fenolkloroform oldattal történő extrakció
egy lépésben sejtfeltárás és szerves-vizes folyadék fázisú extrakció.
A vizes fázis csak totál RNS-t tartalmaz ( és némi kromoszómális DNS
szennyezést, DNázI kezeléssel eltávolítható
NH
+
N
N
NH2
[S]
guanidin és izotiociánsav sója
17
mRNS tisztítás
eukarióták esetén stabil poliA farok
mRNS
tRNS
rRNS
h
o
AAAAAAAAA
r
TTTTTTTTTT- d
o
z
ó
magas só
mRNS
h
o
AAAAAAAAA r
TTTTTTTTTTd
o
z
ó
alacsony só
mRNS
AAAAAAAAA
18
DNS ELVÁLASZTÁSA
ELEKTROFORÉZIS
denaturáló
nem-denaturáló
lúgos, (DNS, agaróz)
formaldehid, glioxál, DMSO
(RNS, agaróz)
Nincs roncsoló ágens
urea (DNS, akrilamid)
méret
> 50 kb
100bp-50 kb
< 1000 bp
Mátrix
technika
agaróz
pulzáló gélelektroforézis
agaróz 0.5- 2%
hagyományos gélelektroforézis
poliakrilamid
(5-20%) hagyományos
LÁTHATÓVÁ TÉTEL:
etídium bromid, interkaláló festék nem-denturáló körülmények,
elsősorban duplaszálú DNS-t fest, de egyszálú nukleinsavakat is.
A DNS 254 nm-en elnyel energia a festékre  590 nm-en emisszió, a festék maga 302 és 366 nm-en nyel el
Lehet gélbe rakni, utófesteni, illetve a mintához adni.
Érzékenység kb 10 ng
Egyéb festékek,
fluoreszkáló anyagok: pl. fluoreszcein, minden körülmény között
.
radioaktivitás: minden körülmény között, 35S, 33P, 32P beta sugárzók
19
Agaróz
szerkezete
20
etidium bromid & DNS
Horizontális gélelektroforézis
21
Géldokumentáció
22
23
Poliakrilamid gél futtató berendezés
24
Vertikális gélelektroforézis
(PAGE)
25
DNS IZOLÁLÁSA GÉLBŐL
- közös pont: először elektroforetikus úton elválasztjuk a DNS-t
- a megfelelő sávot kivágjuk steril pengével
AGARÓZ
- dialízis, dializáló hártyában, elektrodialízis
a kapott DNS további tisztítása fenolos extrakcióval, alkoholos
kicsapással, univerzális, széles mérettartomány
- fagyasztásos
módszer : a kivágott – DNS-t tartalmazó - agarózdarabot –80oC-on
megfagyasztjuk az agarós szerkezete roncsolódik,
ebből a DNS egy szűrőn keresztül centrifugálással kinyerhető
további tisztítás szükséges, univerzális
- kromatográfiás módszerek
6M NaI mellett a DNS 55oC-on (az agaróz megolvad) szilikagél felületére kötődik,
a mátrix mosása után innen o55 C-on alacsony só(víz, TE) eluálható,
majdnem univerzális, elég széles mérettartomány
DEAE membránba futtatjuk a DNS-t,
innen magassókoncentrációval (1.5M) magas hőmérsékleten eluálható
nagy tisztaság, szűk, alacsony mérettartomány < 1.5 – 2 kb esetén
jó a kitermelés
POLIAKRILAMID (PAGE)
a kivágott darabot passzív módon vagy elektromos térben eluáljuk
majd töményítjük, ioncserésen tisztítjuk
26
DNS/ RNS MÉRÉSE
A különböző nukleotidoknak 260 nm körül erős abszorbanciájuk van.
Egyszálú DNS esetén:
e(cm3/(µmol * cm)
bázis
dA
dG
dC
dT
átlagosan
15.4
11.7
7.5
8.8
e= 10 (cm3/(µmol * cm)
Ez leginkább oligonukleotidok esetén használatos.
Nagyobb egyszálú, kétszálú DNS-k, RNS-k esetén a bázisok kölcsönhatásamiatt a számítás módosul
1 cm-es küvettában 260 nm-en 1.0 az abszorbanciája
50 µg/ml kettősszálú DNS-t
33 µg/ml egyesszálú DNS-t
40 µg/ml egyesszálú RNS-t
tartalmazó oldatnak
A fehérjék 280 nm-en nyelnek el. Az A260nm/A280nm arány a nukleinsav tisztaságára jellemző
A260nm/A280nm  2  tiszta a preparátum
A260nm/A280nm  1 - 1,5  sok a fehérje szennyezés
Egyéb módszerek: fluoreszcein, kemilumineszcens festékekkel. Érzékenyebb, de fluorimétert igényel.
27
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN
HASZNÁLATOS ENZIMEK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK
Enzim
Felismerôhely
hossza
Felismerô-hasítóhely Forrás organizmus
AluI
4
HphI
5
GGTGAN8/
EcoRI
6
G/AATTC
BamHI
6
AG/CT
G/GATCC
Arthrobacter luteus
Haemophilus parahaemolyticus
Escherichia coli
Bacillus amyloliquefaciens H
Ragadós végeket adó hasítások (sticky end)
5' túlnyúló
SalI
6
5' G TCGAC 3'
3' CAGCT G 3'
Streptomyces albis
6
5' GGTAC C 3'
3' C CATGG 5'
Klebsiela pneumonia
3' túlnyúló
KpnI
Tompa végû hasítások (blunt end)
HaeIII
4
5' GG CC 3'
3' CC GG 5'
Haemophilus aegyptus
28