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生物多样性原理与保护2
实验十二 过氧化物酶活性的 测定 ——愈创木酚比色法 一、实验目的 1、掌握过氧化物酶活性测定的原理 2、熟悉酶液提取方法,掌握愈创木酚法测定 过氧化物酶(POD)活性方法。 二、实验原理 RH2+ H2O2→2H2O + R 过氧化物酶(POD)可以清除代谢过程中的H202,反应 中被氧化的物质可以是多种多样的,因而其生理效 应也具有多样性,但清除H202毒害作用是共同的。 在H202存在时,过氧化物酶可将邻甲氧基苯酚(即 愈创木酚)氧化成红棕色的4一邻甲氧基苯酚,其 红棕色的物质可用分光光度计在436nm处测定其消 光值,产物浓度与A436成正比,即可求出该酶的活 性。 三、实验步骤 1.酶液提取 ⑴称取样品适量(如果皮1g) ⑵研磨:剪碎置于研钵中,再加少许水和石英砂,研磨成 匀浆。 ⑶定容:把研钵中的研磨物,移入100ml容量瓶中定容。 ⑷离心:取一定量离心沉淀(10000r/min冷冻离心 20min)。 ⑸酶液保存:再取其上清液保存在冰箱(或冷处)备用。 2.酶活性测定 ⑴标准曲线制作:取7个10ml刻度试管编号,分别加入 5g/ml的英格盐溶液10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0 m1, 然后稀释至刻度。其浓度分别为每毫升含5、4、3、2、1、 0.5、0g的4一邻甲氧基苯酚。用分光光度计在470nm处测定 其消光值。以消光值为纵坐标,以4一邻甲氧基苯酚浓度为横 坐标绘制成标准曲线。 ⑵测定:在20ml刻度试管中,分别加入pH5.0醋酸缓冲 液1ml,0.1%邻甲氧基苯酚1ml及酶溶液1ml(如酶活性较强, 可稀释10倍后再取1ml),摇匀后,置于30℃恒温水浴5分钟 达平衡后,立即加入0.08%H2O2溶液1ml并混匀,1分钟后生 成红棕色的4一邻甲氧基苯酚的溶液。立即倒人比色杯中,测 定其消光度。重复三次,并设对照,用1ml蒸馏水代替0.08% H2O2。从标准曲线上求出相应的4一邻甲氧基苯酚的含量 (1g 4一邻甲氧基苯酚相当干1单位的愈创木酚)。 四、 实验结果 1.酶活力单位定义:每分钟增加0.01 A436nm值为一个酶活 力单位(U)。 ΔA436×D 酶活力(U) = 0.01×W×t 式中: ΔA436 ——反应时间内OD变化值。 W ——植物鲜重(g)。 t ——反应时间(min)。 D ——稀释倍数 (即酶提取液体积÷反应系统内酶液体积) 2.计算不同测定时间的反应速度(v),作出v与t 的曲线图并观察反应速度与时间的关系。 POD酶活力大小:以最初的反应速度(v)来表示POD酶 活力; 记录实验主要步骤,求出过氧化物酶的活性。 过氧化物酶活性= ΔA436×VT W×t 式中: ΔA436 ——反应时间内OD变化值。 VT ——提取酶液总体积(mL)。 W ——植物鲜重(g)。 t ——反应时间(min)。 五、讨论分析 ⑴过氧化物酶的变化说明了什么? ⑵试述过氧化物酶测定原理?
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