Transcript 课程总结和部分技术介绍
课程总结 和 部分技术介绍 1 第二章 分子生物学常用基本技术 实验1 重组质粒 实验2 质粒转化大肠杆菌 实验3 阳性单菌落扩增与小量DNA制 备 实验4 酶切重组质粒，电泳分离所插 入的DNA 实验5 从凝胶中回收DNA 2 实验6 大量质粒DNA制备 3 实验7 哺乳类动物细胞的培养 实验8 植物细胞悬浮培养技术 4 第三章 DNA的研究方法 目的： （1）获得目的DNA（人、动物、植物；组织、细 胞），开展基因组的研究。 （2）扩增目的DNA的量。 （3）了解DNA大体结构（亲子鉴定/破案）。 （4）了解DNA缺失、突变、保护、修复。 （5）了解DNA功能和功能域确定。 （6）启动子研究：启动子结构、增强子、甲基化 。 5 实验9 哺乳类动物基因组DNA的提取 （类似于RNA的提取） 实验10 植物基因组DNA的提取（采用 抗氧化剂或强还原剂以降低植物细胞中氧化酶类的活 性） 实验11 基因组文库的建立与筛选 （类 似于cDNA文库的建立与筛选） 实验12 Southern blot （类似于Northern blot ） 6 实验13 PCR PCR是Polymerase chain reaction的缩写，中文译作 聚合酶链式反应。其特点是可以在几小时内方便、快 捷地将微量DNA（含由微量RNA反转录成的cDNA） 扩增达106倍，得到ug级的DNA！该技术发明于八十年 代中期，到了八十年代末，由于引用了耐热DNA聚合 酶，使这一技术得以蓬勃发展，成为分子生物学中应 用最为广泛的技术。 该技术在中医药实验研究和临床检测中应用十分 广泛。例如观察慢性炎症的活检组织中一些与肿瘤发 生的基因是否存在突变，中医药治疗后防突变的作用 如何（如同一患者气管脱落细胞与血细胞比较）等。 7 原理： 8 注意事项 PCR的常见问题主要有： 1．没有PCR产物。其主要可能有PCR反应的有关 试剂缺乏，循环次数不够，退火温度太高，引物设计 不好，模版不够，模版质量差，变性温度过高或过低 ，变性时间过长或过短，链延伸时间过短，Taq酶数量 不够或质量不行，Mg++ 过低，dNTP过少，模版C/G过 于丰富，等等。 2．PCR产物不纯，见多条条带产物。其主要可能 有循环次数太多，退火温度过低，引物设计不合理， 污染等。其中，引物设计不合理的可能性最大。 3．PCR产物前后一片，拖带。其主要可能有循环 次数太多，退火温度太低，链延伸时间过长，模版质 量差，模版过多，污染，Taq酶数量过多，Mg++过多， 等等。 9 4．关于引物 （1）引物的长度。引物的长度要求不一，如模版 是单一的载体和单一的插入片段，可以选用较短的插 入片段两侧的载体序列作为引物，一些常用载体有现 成的引物商品，可以购买。对于复杂的基因库，或反 转录产物，为提高引物的特异性，建议采用较长的引 物。具体可以参见RACE PCR介绍。 （2）引物的CG与AT的比例。可能的话，建议1:1 左右。 （3）引物的计算机设计参见本书RTPCR介绍。 5．关于酶。一些实验反复失败，竟然会与酶的质 量问题有关。因此，我们建议购买那些经常从事PCR 实验的实验室所经常使用品牌及其供应商的PCR酶。 10 6．退火温度。通常按照检索到的文献或试剂盒提 供的方法，可以确定退火温度。但是，时常会碰到两 条引物的Tm值不一致，或PCR反复调整仍不见改善， 此时可以考虑Touch-Down-PCR的方法，具体参见本书 RACE-PCR介绍。 7．CG丰富的DNA模版往往不容易扩增。对此， 可以采用DMSO（DIMETHYL SULFOXIDE），用量 为PCR反应总容积的1/10。比如将4ul的DMSO加入36ul 的PCR反应液，使总容积达40ul。 8．MgCl2。通常PCR buffer中含有MgCl2，但是由 于一些不清楚的原因，有时仍嫌不足，此时可以适当 增加MgCl2的浓度。 11 9．PCR是一种十分灵敏的实验，对操作技巧要求 高，为防止加样误差，建议做复管。同时，同时进行 多个反应时，相同的试剂建议先一道配制，并留有余 量，比如Taq酶、10×PCR Buffer、dNTP、消毒过的双 蒸水等，混匀，这样可以很大程度上避免上样误差。 10．关于电泳参见本书有关章节。 11．关于试管。为提高PCR的质量，以及大批量 PCR反应的操作，目前业已开发出不同的PCR试管。 比如为减少管壁导热的延滞，发展出超薄壁的PCR试 管；为满足批量实验，发展出排状PCR试管，等等。 我们在实验中先后使用过一些不同的试管，从操作方 便和安全上看仍喜欢采用0.5ml的试管。这样的试管比 较结实，不宜引起试管的破裂和同位素的泄漏，且手 持起来方便。 12 实验14 DNA双脱氧链终止法测序 目的： 1．了解目的DNA序列，如获得的DD-PCR片段。 2．了解目的基因是否发生了突变、缺失。例如经 中医药治疗或处理后是否可以阻止或纠正病变组织基 因组的突变。 3．一些实验如Footprint要求在足迹电泳的一侧有 DNA的序列，以明确核蛋白所结合启动子的区域。 鉴定某一基因是否为目的基因。 测序有一些不同的方法及其改良法，比如化学降 解测序法，九十年代还发展起来多种自动测序仪，并 不断升级换代，给大量的测序工作提供了快捷、便利 的条件。若测序工作量不大，或没有自动测序仪，可 以采用本实验介绍的方法。 13 原理： 14 实验结果： 15 实验15 动、植物药材的ISSR指纹图 谱技术（单一引物对目标组织微卫星序列PCR扩增 ） 实验16 中药RAPD指纹图谱技术（随机 多态核苷酸引物对目标组织基因组DNA的PCR 扩增） 16 第四章 RNA的研究方法 （1）获得RNA（人、动物、植物；组织、细胞） ，开展转录组学研究。 （2）了解RNA的质量和特征。 （3）获得mRNA。 （4）扩增目的RNA。 （ 5 ） 了 解 目 的 RNA 的 表 达 量 ——RT-PCR 和 Northern blot。 （6）了解目的RNA的表达的位置和表达量——原 位杂交。 （7）了解目的RNA序列。 17 实验17 组织总RNA提取 正常小鼠垂体RNA图谱 邪毒壅盛小鼠垂体RNA图谱 气虚小鼠垂体RNA图谱 阳气虚小鼠垂体RNA图谱 气阴阳虚小鼠垂体RNA图谱 RNA降解 18 实验18 mRNA的分离 实验19 Northern blot 19 实验20 RT-PCR 实验21 ABI荧光实时定量PCR 20 实验22 原位杂交 实验23 基因芯片 MicroArray 的 工 作 原 理 是 将 欲 研 究 细 胞 组 织 的 RNA通过不同的方式转录成cDNA，转录过程中或之后 给予荧光等标记，制成探针，然后在严格的条件下使 该探针与微矩阵上的基因杂交，杂交后，把未杂交的 基因洗脱，在一定的条件下，观察杂交结果，以了解 某特定组织中基因转录的多寡和特征。如果两个组织 的RNA用不同发光色彩的荧光标记，同时进行杂交， 由于两个组织杂交后所激发的荧光色彩不同，微矩阵 上与甲组织特有探针结合则产生甲探针的光色，与乙 组织特有探针结合则产生乙探针的光色，两种探针同 时结合则产生相兼色。这样在一块基因芯片上就可以 方便、迅速、大规模地观察两个不同组织基因转录的 异同。 21 22 在基因芯片问世的短短 几年来，一些改进型的基因 芯片技术陆续问世，并迅速 形成产品。比如GeneChip。 其特点为： （1 ）容量大，每个芯 片上可以达39000个基因/百 万个探针，因此，单位时间 内识别的基因多且快； 23 （2）在基因矩阵上每个点 由上下两排更小的矩阵组成，每 排由16～20个与某一mRNA不同 区域对应的25个寡核苷酸组成。 上下两行中，上行为正常基因序 列，下行为中间有点突变的序列 。这样在相同严格的杂交和洗脱 条件下，上行基因16～20个点应 该全部阳性反应，而下行基因因 含有点突变，退火结合后不够稳 定，会被洗脱。因而这样仅上行 呈阳性的杂交才算有效。所以在 避免假阳性方面具有别的芯片所 无法比拟的优势。 24 使用基因芯片技术还有以下一些问题： 1．要求专门设备，国内尚未普及。 2．研究成本高。 3．不是所有常用生物均有全RNA组芯片。 4．实验数据庞大。 5．大量的基因功能还不明朗。 25 虽然如此，基因芯片技术已展现出绚丽的前景： 1．已经出品了人类全套基因组芯片，使基因芯片 完全实用。 2．当基因芯片生产技术趋于成熟，开始批量化、 规模化生产，降低售价，便于普及。 3．生物计算技术的发展，芯片结果自动化分析程 度增加，将使人类更好、更快地驾驭基因芯片的海量 信息。 4．不同基因功能研究的积累，以及基因功能研究 技术的发展与普及，使基因芯片研究的后续工作得以 有效的开展，基因芯片的学术价值将得到革命性的发 展。 5．互联网海量生物信息开放和不断丰富，以及有 关计算机辅助系统的发展与升级，使芯片结果的分析 与深入研究空前的便利。 26 Affymetrix Rat 230A GeneChip 27 外显子芯片 ——基因的剪接差异 ——产物的多样化 Affymetrix GeneChip® mouse Exon 1.0 ST Array 28 POMC的表达产物可以是β-内啡肽或ACTH 小 鼠 POMC 基 因 全 长 5.668 kb ， 位 于 染 色 体 12 的 3954967（或3954951）到 3960634（或3960618）。该基 因有3个外显子，其起始位置大体为：3954967～3955070 （103bp），3958100～3958280（180bp），3959900～ 3960634（734bp）。后两个外显子存在编码区 。合计 1017bp左右。 29 信号肽 N—端片段 γ1-3MSH ACTH(1-39) α-MSH(1-13) CLIP(18-39) β-LPH γ-LPH β-END β-MSH translation="MPRFCYSRSGALLLALLLQTSIDVWSWCLESSQCQDLTTESNLLACIRACKL DLSLETPVFPGNGDEQPLTENPRKYVMGHFRWDRFGPRNSSSAGSAAQRRAEEEAVWGDG SPEPSPREGKRSYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNVAENESAEAFPLEFKRELEGERPLG LEQVLESDAEKDDGPYRVEHFRWSNPPKDKRYGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAHKKGQ " （1）γ1-MSH（γ1促黑素细胞激素，YVMGHFRWDRF）。 （2） γ2-MSH（γ2促黑素细胞激素，YVMGHFRWDRFG）。 （3） γ3-MSH（γ3促黑素细胞激素，YVMGHFRWDRFGPRNSSSAGSAAQ）。 （4） ACTH（SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNVAENESAEAFPLEF）。 （5） α-MSH（α促黑素细胞激素，SYSMEHFRWGKPV）。 （6） CLIP（corticotropin-like intermediate lobe peptide，中间叶促皮质样肽）。 （7） β-LPH（lipotropin，促脂解素）。 （8） γ-LPH（lipotropin，促脂解素）。 （9） β-END（β-内啡肽，YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAHKKGQ）。 （10） α-END（α-内啡肽，YGGFMTSEKSQTPLVT） （11） γ-END（γ-内啡肽，YGGFMTSEKSQTPLVTL） （12） δ-END（δ-内啡肽，YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAH） （13） β- MSH（β促黑素细胞激素）。 30 小鼠外显子芯片，有关POMC基因，有4组探针，第4组基本不 表达（作图取前3组探针）。其中，探针2落在ACTH内。4组探针杂 交结果如下： AAACGGGAGGCGACGGAAGAGAAAAGAGGTTAAGAGCAGTGACTAAGAGAGGCCAC TGAACATCTTTGTCCCCAGAGAGCTGCCTTTCCGCGACAGGGGTCCCTCCAATCTTGTTT GCCTCTGCAGAGACTAGGCCTGACACGTGGAAGATGCCGAGATTCTGCTACAGTCGCTC AGGGGCCCTGTTGCTGGCCCTCCTGCTTCAGACCTCCATAGATGTGTGGAGCTGGTGCC TGGAGAGCAGCCAGTGCCAGGACCTCACCACGGAGAGCAACCTGCTGGCTTGCATCCG GGCTTGCAAACTCGACCTCTCGCTGGAGACGCCCGTGTTTCCTGGCAACGGAGATGAAC AGCCCCTGACTGAAAACCCCCGGAAGTACGTCATGGGTCACTTCCGCTGGGACCGCTTC GGCCCCAGGAACAGCAGCAGTGCTGGCAGCGCGGCGCAGAGGCGTGCGGAGGAAGAG GCGGTGTGGGGAGATGGCAGTCCAGAGCCGAGTCCACGCGAGGGCAAGCGCTCCTACT CCATGGAGCACTTCCGCTGGGGCAAGCCGGTGGGCAAGAAACGGCGCCCGGTGAAGG TGTACCCCAACGTTGCTGAGAACGAGTCGGCGGAGGCCTTTCCCCTAGAGTTCAAGAG GGAGCTGGAAGGCGAGCGGCCATTAGGCTTGGAGCAGGTCCTGGAGTCCGACGCGGAG AAGGACGACGGGCCCTACCGGGTGGAGCACTTCCGCTGGAGCAACCCGCCCAAGGACA AGCGTTACGGTGGCTTCATGACCTCCGAGAAGAGCCAGACGCCCCTGGTGACGCTCTT CAAGAACGCCATCATCAAGAACGCGCACAAGAAGGGCCAGTGAGGGTGCAGGGGTCTT CTCATTCCAAGGCCCCCTCCCTGCATGGGCGAGCTGATGACCTCTAGCCTCTTAGAGTTA CCTGTGTTAGGAAATAAAACCTTTCAGATTTCACAGTCGGCTCTGATCTTCAATAAAAACTG CGTAAATAAAGTC * Affy的3组探针（每组4个探针）：探针组1、探针组2、探针组3、探 针组4，ACTH 编码区、内啡肽 编码区。第2外显子。 31 POMC基因表达的改变： 250 500 450 400 芯片读数统计值 芯片读数统计值 200 150 100 50 350 300 探针1 探针2 探针3 250 200 150 100 50 0 0 正常对照 邪毒壅盛 气虚 阳气虚 气阴阳虚 正常对照 邪毒壅盛 70000 16 60000 14 50000 40000 探针1 探针2 探针3 30000 20000 10000 阳气虚 气阴阳虚 不同证候小鼠下丘脑该基因 下丘脑/垂体*1000 芯片读数统计值 各组小鼠下丘脑POMC表达 气虚 12 10 8 6 4 2 0 0 正常对照 邪毒壅盛 气虚 阳气虚 气阴阳虚 不同证候小鼠垂体该基因 探针组1 探针组2 探针组3 正常小鼠POMC下丘脑/垂体比 32 外显子1 外显子2 外显子3 ACTH ↑ ↑ ATG ATG β-END ↑ ATG --------------------------------------- ACTH -------------------------------------------------- ↑ ATG ------------------- β-END ---------------------- 以上结果表明，当外显子2被剪接掉，该基因的编码 起始位置落在ACTH的编码区内，这样ACTH便得不到编 码。也就是说，该基因的表达产物没有了ACTH。请注意， 下丘脑生理状态下如此，但是邪毒壅盛组改变了，可以表 达ACTH ！这会产生什么结果呢？ 33 荷瘤小鼠肾上腺的RT-PCR表明，肾上腺POMC基 因也存在剪接差异，其中第3、5泳道（分别为早期气 虚、中晚期气阴阳虚）出现220bp左右的PCR产物，正 好是第二外显子（180bp）剪接掉的结果。 34 实验24 cDNA Array 与 基 因 芯 片 原 理 类 似 的 有 cDNA Array 。 例 如 CLONTECH Laboratories公司的Atlas cDNA Expression Arrays是其代表。其cDNA Array的矩阵点由肉眼可见大 小的cDNA点组成，点于96孔板大小的硝酸纤维素膜上 。工作原理是，抽提组织的总RNA或进一步分离mRNA ，用反转录酶和同位素反转录mRNA成cDNA探针，与 膜上的cDNA杂交，放射自显影。不同的组织分别用一 张膜。其放射自显影结果可以用肉眼识别。该公司还配 套有分析软件，实验结果扫描后可以通过软件比较不同 组织基因转录的差异。因此该Array的优点为1）不要求 专用仪器设备，一般实验室均可以操作。2）实验结果 肉眼可以识别，以便调整曝光时间，以获取最佳实验结 果。3）配套有分析软件，可以借助普通扫描仪和计算 机分析实验结果。 35 36 37 原理 CLONTECH将目前许多研究领域热门的上千个基 因分类点于带正电荷的尼龙膜上。这些基因大多已证 明在不同的生物学进程中起到关键作用，比如癌基因 、抑癌基因、细胞循环调节因子、离子通道、DNA结 合蛋白、细胞表面抗体、细胞粘附受体、细胞信号和 细胞外联系等，从而实验将提供较大信息量的结果。 同时，将质粒和噬菌体DNA作为阴性对照点于矩阵之 侧，以验证杂交的特异性。伴随有一些看家基因的 cDNA作为阳性对照以观察正常mRNA的丰度。以上各 基因名称及在GenBank中的编号该公司有专门材料提 供。 38 实验首先将1ug的mRNA在含相应同位素和试剂盒 提供优化了的引物的反应液中反转录成cDNA探针。然 后用此探针与cDNA Array尼龙膜上的cDNA杂交，在严 格的洗膜后放射自显影，然后进行分析，比较不同基 因或不同膜上同一基因表达的多寡。该公司还有配套 的计算机图象分析软件。 39 实验结果 在放射自显影的X光片上见有不同深浅的杂交斑点 ，在斑点矩阵的周围有一些看家基因的定位杂交点。 可以通过试剂盒提供的印有网格的塑料膜确定不同基 因表达的变化，或借助于该公司设计的分析软件对扫 描入计算机的图象进行处理。 40 注意事项 1．通常cDNA Arrays是用来比较两个标本以上的 mRNA表达的变化，因此具体操作时可以同时标记两 个或两个以上的探针，每一个探针的标记方法同上。 为了减少上样误差，除mRNA外，其余试剂可以先统 一配置，混匀，然后分别加入不同来源的mRNA中进 行探针的标记。 2．我们曾作过比较，采用总RNA不理想，mRNA 浓度不够，背景高。采用mRNA的效果比较理想，因 此我们推荐采用mRNA标记探针。mRNA的分离方法 请参见本书有关章节的论述。 41 3．常用的同位素有[α-32P]dATP和[α-33P]dATP，我 们使用下来，[α-32P]dATP效果比较好，曝光时间短， 变化明显，灵敏度高。对于那些强反应的部位，可以 方便地调整曝光时间，取得最佳效果。[α-33P]dATP则 要求较长的曝光时间，对比反而不够灵敏。 4．当鲑精DNA浓度很高时，一旦冷却，不易溶解 ，因此可以变性后，趁热直接加入已加热的 ExpressHyb，并混匀。 5．探针的变性是必须的。常见的问题是标记完探 针，分离去未标记的同位素后，忘记将探针变性，引 起实验失败。 42 实验25 DD-PCR 目的：同时观察大量未知基因转录变化。 中医药治疗疾病通过改变和调整哪些基因的转录 ，不同产地的天然中药其有效成分表达的不同是由于 那些基因表达差异所造成的，中医证的变化主要有那 些基因变化的基础，等等。这类问题摆在中医科学工 作者面前，要求解决。但是，茫茫基因，从而着手？ 以往的研究主要观察一至若干个已知与某病相关的基 因与疾病或证的关系，但由于基因不是单独存在的， 其表达调控有赖于其他许多基因产物的调节，反过来 ，其产物也会对其他基因产生调节和影响。那么复杂 的生命现象通过观察若干个基因往往是难以满足研究 的要求的。而DDPCR技术的产生，提供了便捷的工具 。 43 原理： 44 实验结果 45 实验26 cDNA库建立 实验27 基因全序列cDNA库筛选 46 实验28 RACE-PCR RACE PCR 是 当 前 比 较 热 门 的 技 术 。 RACE 是 Rapid Amplification of cDNA Ends的缩写，是迅速扩增 cDNA末端的意思。其扩增的方法是采用PCR。因而缩 写作RACE PCR。本方法的特点是可以在实验条件和 经验相对比较差，而且在较短的时间内完成对一些基 因片段的全部表达序列完成测定。由于方法简单，复 加PCR的特点，可以同时对若干基因进行筛选，提高 cDNA库筛选的效率。 因此，在中医药研究中发现一些比较小的基因片 段，可以尝试该方法，筛选全基因的克隆。 47 原理 根据所欲筛选基因的已有片段的序列 ，并参照 cDNA库插入基因两端载体或引物的序列，依据实验需 要设计出已有片段5’或3’端的一至二对引物，以cDNA 库为模版进行PCR。电泳鉴定PCR产物，取条带单一 者克隆、测序。如果PCR放大的cDNA测序结果在引物 所在原目的基因片段附近的序列与引物与目的基因片 段一致的话，提示实验成功，且所扩增的部分系位于 原目的基因片段与cDNA库载体或引物之间的序列。如 果所扩增的序列总长度与Northern blot所示分子量大小 一致的话，表明该基因的全部克隆已经得到。完成了 cDNA库的筛选。不然要求依据新延伸的部分进一步设 计引物，开展下一轮的RACE PCR，直至将全部基因 扩增完毕。 48 49 实验结果 1．实验顺利的话，可以在紫外透射仪上看见清晰 的呈淡橘红色的一条PCR产物，其分子量大小符合期 望结果。 2．有不少实验会不顺利。主要表现有：1）有许 多条带；2）没有明确的条带，前后呈拖带状，或中间 似有一些条带；3）没有条带。 50 相应的解决的方法： 1）找出其中分子量最接近的一二个条带，从凝胶 中回收，作进一步的PCR，希望得到单纯的条带。如 果出现类似与前面的多条带结果，表明引物的特异性 不强，参照已知基因片段序列，重新设计引物。 2）常见的情况是依据已知基因所设计的引物特异 性不强所致。可以重新设计引物。 3）建议重复PCR，如果结果同前，且对照PCR呈 阳性，排除PCR方法或试剂的因素，则建议检查cDNA 库的质量。当cDNA库的质量没有问题，则要求重新设 计引物。并参照以下注意事项。 51 注意事项 1．PCR要求高质量的模版，对于那些大的片段尤 其如此。RACE所使用的模版主要来源于cDNA库。 cDNA库有不同的构建方法：有采用λ噬菌体的、有采 用质粒的，也有采用PCR的。如果所采用的cDNA库的 背景不甚清楚，建议向所获得实验室了解构建库所用 载 体 或 引 物 近 插 入 片 段 端 的 序 列 ， 以 便 设 计 RACE PCR所用序列。 52 2 ． Touchdown PCR 。 许 多 情 况 下 ， Touchdown PCR可以有效改善PCR的实验结果。该方法的基本思 路是：在PCR循环的早期若干个循环（5～10个），将 PCR所期望的退火/延伸温度由高（典型的为提高3～ 10℃）逐渐降低，比如80℃、78℃、76℃、74℃、72℃ 等，最后达到期望的退火温度。其目的是通过由高而 低的温度变化，选择两个引物的最佳退火温度，以提 高引物退火的特异性。 53 3．其它关于PCR的注意事项请参见PCR等有关章 节。 4．引物设计要求Tm至少70℃，即至少长22mers ，以25～30mers为好，其中C/G的比例建议在45～60% 之间。两个引物的Tm一致。 54 第五章 蛋白质的研究方法 实验29 哺乳类动物组织蛋白质的提取 实验30 植物组织蛋白质的提取 实验32 ELISA 55 实验31 Western blot 56 实验33 免疫组织化学 实验34 单克隆抗体制备 57 实验35 蛋白质双向电泳 58 第六章 基因功能与表达调控 的研究方法 59 实验36 RNAi RNAi（RNA interference）根据目的基因编码区（ cds）序列设计siRNA，并将其对应的DNA双链序列克 隆入表达载体内，位于该载体RNA聚合酶Ⅲ启动子之后 。当将载体导入目标细胞后，在RNA聚合酶Ⅲ的作用下 转 录 出 带 有 发 夹 结 构 的 dsRNA 分 子 （ 即 shRNA ） ， dsRNA分子被一种RNase Ⅲ类的核酸酶Dicer切割成21～ 25nt的siRNA，siRNA进一步与其它多种蛋白成份结合 形 成 RNA 诱 导 的 沉 默 复 合 体 （ RNA-induced silencing complex，RISC），最后由RISC介导siRNA反义链与靶 mRNA分子互补结合，并引起靶mRNA分子的切割、断 裂，从而难以表达出其基因产物，实现沉默该基因表达 的目的。 60 61 pSilencer2.1质粒 62 加入MTT后，溶液呈浅黄色 加入DMSO后，溶液呈紫色 63 1400 1800 1600 1200 芯片读数计算值 芯片读数计算值 1400 1200 1000 800 600 1000 800 600 400 400 200 200 0 0 正常 肝癌 西药 全方 请热 活血 正常 健脾 4周 8周 16周 肝癌 不同治法对大鼠肝癌IFRD1的作用 IFRD1在DEN诱导大鼠肝癌不同阶段的表达 1.400 1.000 正电高 阴性高 IFRD1高 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 1d 3d RNAi基因转染后时间 6d 吸光度（A490）OD 吸光度(A490)OD 1.200 0.900 0.800 0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 正电中 阴性中 IFRD1中 1d 3d RNAi基因转染后时间 6d 高浓度IFRD1 RNAi后生长曲线 低浓度IFRD1 RNAi后生长曲线 IFRD1 （interferon-related developmental regulator 1，又称PC4、TIS7） 64 实验37 Small RNA的提取与分析 实验38 报道基因与基因调控元件的检测 65 绪论曾提到过，GnRH基因是如何表达的？该基因 的启动子中，哪些区域是重要的（增强子），如何确 定？ GnRH基因 GnRH基因启动子 GnRH基因编码序列 300 250 200 150 系列1 100 50 启动子片段 报道基因 0 1 2 3 4 5 方法：把以上启动子切割成若干片段， 分别插入报道基因前面。该含启动子片段和报道基因表达载体转染 工具细胞后，如果某一启动子片段对该基因高表达十分重要，则报道基 因产物的读数会很高，如右图。如此可确定哪些启动子区域重要。 66 实验39 点突变PCR 点突变PCR的使用机会越来越多了起来。当研究 发现中医药对某些特定基因的具有调整作用以后，自 然要求深入了解实现对该基因调整的具体途径，比如 中医药对某基因的调整是直接的，并通过这样的调整 发挥疗效，抑或是间接的；如果这些基因的功能尚不 清楚，那么，哪些部位是主要的功能区，改变了这些 功能区会如何；在这些基因中中医药可能对启动子的 哪些部位发生作用，等等，点突变PCR技术可以为回 答这些疑问提供方便。 67 本方法是利用PCR技术，改变目的基因的个别或 若干碱基，使该碱基所处位置的基因功能发生变化， 以观察其意义。例如对于功能基因，可以检测点突变 后功能是否发生变化，以逐步明确功能区的意义；或 直接破坏一些已明确的功能区，使该基因失去原有功 能；或用于筛选启动子中的重要序列、增强子的位置 ，了解一些已知转录调控蛋白及其特定结合序列的关 系，等等。 点突变PCR技术的实现主要有两种方法，一种是 比较老的办法，叫做两步法点突变PCR；另一种发展 比较晚，并得益于Taq酶性能的提高，称之为一步法点 突 变 PCR 。 如 STRATAGENE 公 司 QuikChange SiteDirected Mutagenesis Kit所采用的一步法点突变PCR。 68 原理 采用性能优良的DNA聚合酶 PfuTurbo DNA polymerase，设计 出含有突变位点的一对对应的引 物，将含有目的基因的载体加热 解链，退火时，突变引物会结合 到载体插入片段的相应序列上， 并以此作为引物，延伸。 该方法可以直接完成数千bp 长度的含有插入片段的整个载体 的复制，使复制的DNA含有突变 位点。 69 PCR后，PCR产物用Dpn I消化原先的模版，这是 因为大多来自于大肠杆菌的DNA是甲基化的，对Dpn I 敏感，而新延伸的DNA链则不然。消化后，所消化的 质粒未突变链含有大量的切口，在转化大肠杆菌后， 大肠杆菌会依据突变链将切口修补完善，并予以复制 。从而完成基因的点突变。由于该技术仅使用一次 PCR循环，所以被称为一步法点突变PCR。 70 实验40 基因敲除技术 实验41 Footprint 71 实验42 凝胶阻滞分析 72 实验43 植物细胞的基因转化 73 第七章 分子生物学常用 网络资源及利用 第一节 美国国家生物技术信息中心（NCBI） 第二节 GenBank数据库查询与搜索 第三节 BLAST 第四节 EST的电子延伸 第五节 cDNA序列的蛋白阅读框架分析（ORF） 、染色体定位，及其在机体各组织中的表达预测 第六节 PCR引物或序列寡核苷酸探针的在线设 计 第七节 蛋白质分析 74 NCBI的主页面 75 76