Transcript Présentation intégrine 1

Etude du protocole du TP2
Généralités sur les intégrines
Sylvie Monferran
Etude du protocole du TP2
• 4 manips / 3 jours qui se chevauchent
• TP: projet de recherche… autonomie
• Compte-rendu sous forme d’un article scientifique
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Résumé: à faire à la fin
Introduction: sur les intégrines
Matériels et méthodes: principe de chaque expérience
Résultats et discussion: critique des résultats
Conclusion et perspectives
Adhérence cellulaire
Adhérence intercellulaire
Adhérence homotypique: interaction entre cellules du même type cellulaire
Adhérence hétérotypique: interaction entre cellules de type cellulaire différents
Adhérence cellulaire à la matrice extracellulaire
Extracellular matrix
Nature Review in Molecular Cell Biology
Molécules d’adhérence cellulaire
Frenett et al, N Engl J Med, 1996
Ca2+ dépendantes: cadhérines, sélectines, intégrines
Ca2+ indépendantes: CAM
Intégrines: récepteurs de la matrice extracellulaire
Lame basale
Matrice interstitielle
Famille des intégrines
8 sous-unités b, 18 sous-unités a: 24 intégrines
Liaison à un ligand matriciel
Liaison à un CAM
Hynes, Cell, 2002
Spécificité des ligands des intégrines
beta1
Ligands
alpha1
Collagens, Laminins
alpha2
Collagens, Laminins
alpha3
Laminins, Fibronectin,
Thrombospondin
alpha4
alpha5
alpha6
alpha7
Fibronectin, VCAM
Fibronectin
Laminins
Laminins
alpha8
Fibronectin, Tenascin
alpha9
Tenascin
alpha10
Collagens
Structure des intégrines
Zone d’interaction
avec le ligand
Liaison à
un cation
(Ca2+)
Sept domaines
répétés
en hélices b
MIDAS
Domaine
I/A (vWA)
Domaine extracellulaire:
Interaction avec le ligand
Domaine transmembranaire:
Ancrage dans la membrane plasmique
Domaine cytoplasmique:
Membrane plasmique
Chaîne a
Chaîne b
Interaction avec protéines de
signalisation et du cytosquelette
via la sous-unité b
Humphries, Biochemical Society, 2000
Activation des intégrines
-Activation par l’extérieur de la cellule: liaison au ligand
Signalisation outside-in
Conformation inactive
(recourbée)
Conformation active:
Liaison avec le ligand
Hynes, Cell, 2002
Activation des intégrines
-Activation par l’intérieur de la cellule: liaison à des partenaires protéiques
Signalisation inside-out
Qin, Plos biology, 2004
Liaison des CHO exprimant
aIIbb3 à PAC-1
PAC-1: anticorps mimant la liaison
de l’intégrine aIIbb3 au ligand
LIBS6: anticorps activant
l’intégrine aIIbb3 par l’extérieur
Tadokoro, Science, 2003
Signalisation des intégrines
Protéines adaptatrices
Sos
GDP
GTP
GRB2, CAS
RAS
= MEKK
Activité enzymatique
P
P
Kinases: FAK, PKC
= MAPK
GTPases Rho: Rac, ras
Protéines effectrices
MLCK
Hood et Cheresh, Nat Rev Cancer, 2002
Signalisation des intégrines: la FAK
Structure et activation:
KO FAK: Léthalité embryonnaire à J8
Défaut de migration des cellules du mésoderme
Vidéomicroscopie sur des « fibroblastes »
d’embryons de J8
FAK +/+
Activation de FAK aux points de contact
cellule/matrice extracellulaire:
FAK -/-
Ilic et al, Nature, 1995
Cônes de croissance chez le Xénope
Robles and Gomez,
Nat Neuroscience, 2006
Liaison au cytosquelette d’actine
sauf l’intégrine a6b4 qui se lie aux filaments intermédiaires
Points focaux d’adhérence:
plus de 50 protéines identifiées
Protéines liant l’actine
et permettant la stabilisation
des filaments d’actine préexistants
Nucléation de nouveaux
filaments d’actine
Arp 2/3, formine…
Actine/
myosine
Adhérence
Migration
Taline, parvine…
Delon et al, Current Opinion in Cell Biology, 2007
Fonction des intégrines
Intégrine a3b1 empêche la migration
des kératinocytes murins (MK)
Matrice extracellulaire
Explants de peau
Epiderme
Derme
Test de migration
Survie
cellulaire
Contrôle de la
transcription
Prolifération
cellulaire
Migration
cellulaire
Réorganisation
du cytosquelette
Hynes, Cell, 2002
Margadant, JCS, 2009
Pathologies associées aux intégrines (1)
• LAD (leukocyte adhesion deficiency):
-défaut de recrutement aux sites d’infection des monocytes ou des neutrophiles
-mutations dans le gène codant pour la sous-unité b2 des intégrines: LAD I
-inhibition de l’expression de b2: LADI
-ou expression d’une forme de b2 qui n’est pas présente à la membrane
plasmique ou ne peut pas conduire le signal : LAD I variant
Bunting, Curr Opinion Hematol, 2002
Pathologies associées aux intégrines (2)
•
Cancers:
- Changement de localisation subcellulaire
ex: l’intégrine a6b4 (marquage en jaune)
dans une lignée de carcinome squameux
-Changement du répertoire des intégrines
(inhibition des intégrines qui maintiennent les cellules attachées à la
membrane basale et expression des intégrines qui permettent
invasion, ..)
Ex: l’intégrine avb3 exprimée dans les glioblastomes (GBM) mais pas
dans le cerveau sain (NB)
Intégrine avb3
Glioblastome
Cerveau sain
Bello, Neurosurgery, 2001
Rabinovitz, JCB, 1999
Régulation des voies de signalisation des intégrines par
d’autres récepteurs
Guo, Nat Rev Mol Cell Biol, 2004
Signalisation croisée entre l’intégrine a6b4
et le R de l’EGF type II (ErbB2, neu)
Implantation orthotopique
Acini
mammaire
Signalisation b4
Signalisation b4
IP
Implantation
ectopique
Guo, Cell, 2006
prolifération
invasion
Inhibition directe des intégrines
Expression des intégrines
Activité des intégrines
Interférence d’ARN
Anticorps bloquants
Activité des intégrines
Molécules peptidomimétiques
Tucker, Curr Oncol Rep, 2006
Inhibition indirecte des intégrines
Inhibition des voies de signalisation
Inhibiteurs pharmacologiques dirigés contre la protéine cible
Ex: PKC
Pseudo substrat
Ligand compétitif ATP
Substrat non hydrolysable
Méthodologie pour étude des intégrines
• Déterminer le type d’intégrines exprimé par une cellule
Expression totale
– Western-Blot
Expression à la surface externe des cellules
– Cytomètrie de flux
– Immunofluorescence
– Biotinylation des protéines de surface, puis Immunoprécipitation puis
Western Blot
Test indirect
– Test d’adhésion en présence d’inhibiteurs pharmacologiques des
intégrines (anticorps bloquants, agents peptidomimétiques)
Méthodologie pour étude des intégrines
•Déterminer quelle est la voie de signalisation activée par une intégrine
– Etude de l’expression/activité des protéines en aval des intégrines en utilisant des
inhibiteurs pharmacologiques ou des ARNi dirigés contre les intégrines ou en activant
les intégrines
– Caractérisation des molécules de signalisation (co-précipitations, Western-Blot)
Méthodologie pour étude des intégrines
• Déterminer la fonction d’une intégrine
– Test d’adhésion sur protéines matricielles
Schéma expérimental :
+/-Anticorps/Inhibiteurs
des intégrines
16 h
Substrat
4°C
2-6 h
Cellules
37°C
DO
Fixation
Coloration
Système Cre-Lox