Transcript 형질전환과 플라스미드 DNA분리

형질전환과 플라스미드 DNA분리
조원: 지한범, 제문모, 김건호
실험목차
• 10월29일(첫째 주) : 액체배지 및 고체배지 제조
• 11월05일(둘째 주) : 열 충격방법으로 형질전환
• 11월12일(셋째 주) : 플라스미드 DNA수거
• 11월19일(넷째 주) : 정리 및 실험결과 발표
DNA 재조합기술과 이용
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DNA 재조합 기술이란? 한 생물에서 추출한 특정 DNA를 다른 생물의 DNA에 끼워 넣어 재
조합 DNA를 만든 후, 이를 세균 등에 넣어 유전자를 복제하거나 형질을 발현시키는 기술
을 말한다.
또한 세포 내의 특정 유전자를 골라내어 조작할 수 있고, 특정 유전자를 대량으로 복제하여
유전자에 대한 기초 연구에 이용 하거나, 유전자 변형생물체(GMO)나 형질 전환 생물을 생
산할 수 있다.
대장균 속 DNA
• 플라스미드 DNA란? 대장균과 같은 세균에 주염색체와 별도로 존재
하는 작은 원형 DAN이다.
• 플라스미드는 크기가 작고 분리와 조작이 쉬우며, 다른 세포 내로
쉽게 도입될 수 있다. 또, 생존에 필수적이지 않고 스스로 복제가 가
능하기 때문에 DNA 운반체로 주 사용된다.(항생제 내성 유전자를 가지고 있
는 것이 많아 재조합 DNA를 가진 숙주 세포를 선별할 때 용이하다)
액체배지 만들기
시약 이름
500ml
100ml
Bacto-tryptone
5g
1g
Yeast extract
2.5g
0.5g
NaCl
5g
1g
증류수
To 500ml
To 100ml
고체배지 만들기
시약 이름
500ml
100ml
Bacto-tryptone
5g
1g
Yeast extract
2.5g
0.5g
NaCl
5g
1g
Bacto-agar
7.5g
1.5g
증류수
To 500ml
To 100ml
열 충격방법으로 형질전환
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건강한 세포가 든 튜브를 얼음 위에서 천천히 녹인다
플라스미드 DNA를 녹인 튜브에 넣어준 뒤 얼음에 10분간 꽂아 둔다.
튜브를 42도 물에 넣어서 1분간 열충격을 준다.
튜브를 얼음에 2분간 다시 꽂아둔다.
액체 LB배지를 실험 튜브에 500ul(?)를 넣고 37도 배양기에서 배양 시킨다.
LB고체배지접시에 배양한 액 100ul(?)를 피펫으로 넣고 삼각 유리 막내를 이용하여 도말
평판한다.
도말한 LB고체배지접시를 37도에서 16시간이상 키운다.
플라스미드 DNA수거
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페트리 디쉬에 자란 콜로니를 멸균한 이쑤시개로 선발하여 액체 배지(+AMP)에서 37도에
서 12시간 배양 한다
배양돤 배지를 1.5ml을 튜브에 담아 20초 동안 원심부리 시킨 후 상층의 배지를 제거
침전된 균에 GTE용액 200ul(?) 넣고 피칭 한다.
0.2N NaOH/1% SDS용액을 200ul(?)넣고 3~4회 흔들어 준다.
아세트산 칼륨 용액 200ul(?) 넣고 3~4회 흔들어 준다.
4도에서 12,000rpm에서 10분 원심분리 한다.
원심분리 후 상층액을 조심스럽게 새 튜브로 옮긴다.
아이소 프로필 알코올 0.7ml넣고 -70도에서 15분 방치한다.
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0.2N NaOH/1% SDS용액은 DNA를 두가닥을 한가닥으로 나누어 준다.
EDTA는 세포막의 칼슘이온을 제거 해준다.
아이소 프로필 알코올은 DNA를 침전시키는 역할을 한다.
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결과
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항생제가든1번 배지의1,2를 비교 했을 때 육안으로는 항쟁제가든
배지1이 많이 번식 했는 줄 알았는데 알고 보니 배지2가 많이 자라
서 겹겹이 포개져 있다는 걸 알았다.