Transcript 혈청학적 반응 (20141126) (633Kbyte)

이온결합(정전기적 인력) - 서로 반대의 하전 이온(아미노기;NH3+,
카르복실기;COO-) 사이의 인력, 당기는 힘, 거리 제곱에 반비례(F ∝ 1/d2)
수소결합 – (N-H---O, C-O---H-N)와 같이 수소결합가교 형성
소수결합(Hydrophobic) – Valine, Leucine, Phemylalanine 등
소수성기가 접근하면 그 사이의 물 분자는 배제
Van der Waals 인력 – 3~4Å 이내의 분자간 생기는 비특이적인력,
서로 접근할 수록 당기는 힘은 강해짐
2. 반응성에 따른 항체의 종류
반응종류
항체
반응종류
항체
응집반응
응집소
IgG ,IgM ,IgA
중화반응
중화항체
IgG, IgM
침강반응
침강소
IgG, IgM, IgA
Atopy성
반응
Reagin
IgE
탐식반응
옵소닌
IgG, IgM
보체결합
반응
보체결합
항체
IgG, IgM
용해반응
용해소
IgG(IgG4제외)
IgM
4. 침강원 및 응집원 조건
1) 침강원 조건
① 가용성항원 ; 단백, 다당체, 지질용액, 균체 추출액
② 다가항원(multivalent-Ag)
2) 응집원 조건
① 세균,적혈구,백혈구, virus부유액 등 입자성
② 가용성항원을 피막한 latex, 적혈구 등
5. 항원-항체 양적관계 (침강/응집반응)
1) 최적현상 ; 등량대(equivalent Zone)
- 최적비(optimal ratio) 현상, 침강(응집)반응이
가장 빠르고 많은 침강물 생성
2) 억제현상 : 지대현상(zone phenomenon)
- 전역현상(Prozone-phenomenon)
: 항체 과잉
- 후역현상(Postzone-phenomenon)
: 항원과잉
[문] 초래되는 결과는 ?
[문] 해결방법은 ?
6. Gel내 면역확산법
1) 종류
① 단일면역확산법
ⓐ Oudin 법 : 시험관내
ⓑ SRID 법 : 평판내
② 이중면역확산법(Double immunodiffusion)
ⓐ Ouchterlony법 : 평판내
③ 면역전기영동법 ; IEP
ⓐ IEP(Classic-IEP)
ⓑ CIEP ; 이중단순면역확산법 변형
ⓒ Rocket-electrophoresis ; 단일면역확산법 적용
ⓓ immunofixation EP
ⓔ Crossed-IEP(2D-IEP
단일면역확산법
일차원이중확산법
1) Oudin 법 (single diffusion method)
∙ 0.5% agarose + Ab → agar broth + Ag → White bond 형성 (agar
broth에서 관찰)
2) 일차원 이중확산법 (One dimeasional double diffusion method)
∙ agar layer에 Ag와 Ab가 양쪽에 확산하여 침강대를 형성
한천층에 항원․항체 특이적 반응 개수에 맞게 침강대가 형성됨
② 이차원 이중면역확산법(Double immunodiffusion)
그림 6-10. 이중확산법에 의한 침강반응
3) Ouchterlony 법 (Two dimensional double diffusion method)
∙ agarose 1 ～ 1.5%에 적당한 거리를 두고 필요한 만큼 구멍을 판다.
(직경 : 2 ～ 3mm, 6 ～ 8mm 간격)
∙ 그 hole에 각각 Ag․Ab를 넣어 확산 시킨다.
∙ No. 1 : Standard band 형성 (Ag : Ab
최적비)
2 : Ag이 많을 경우 달무리가 Ag쪽으로
3 : Ab가 많을 경우 달무리가 Ab쪽으로
4 : 항원 입자가 커서 확산이 느리게
일어난다.
5 : 항원 입자가 작아서 확산이 빨리
일어난다.
③ 면역전기영동법
그림 6-12. 면역 전기영동원리
원리 : pH 8.2 ～ 8.6 Veronal buffer sol.(VBS)로 혈청단백을 영동하면
혈청단백은 (-)이온으로 하전되어 양극으로 끌려가는데 이때 등전점에
따라서 끌려가는 속도가 달라진다. 그래서 단백의 종류를 분류할 수 있다.
(buffer와 pH의 차가 클수록 빨리 이동하게 됨.)
7. 응집반응유형별 검사법
응집반응 유형
직접응집반응
간접응집반응
매개물
검사법 종류
세균
Widal test, Weil-Felix etst, 혈청학적 세균동정
혈구
한냉혈구응집반응 ,Paul-bunnell test, ABO typing
Latex
RA test, CRP test
혈구
PHA, RPHA, Waaler Rose test, MiddlebrookDubos반응
간접( 응집 )억제
Latex
반응
plano test
직접법 : 불완전항체감작 혈구 + Coomb's serum
Coomb's법
혈구
간 접 법 : ( 혈 청 중 불 완 전 항 체 + 혈 구 ) + Coomb's
serum
8. 검체 비동화
비동화 유무
사
종
목
Paul-Bunnell test, VDRL, TPHA test, FTA-abs, RPCF, kolmer CF,
TPI
O
O, X
X
검
Widal test, Weil felix, ASLO
한냉응집소검사, CRP test, RA test, plano test, HBs Hg, Anti-HBs,
HI test, RPR
CH50, 한냉용혈반응, IEP,종양표지자검사(AFP,CEA,ferrtin,CA19-9)
[문]비동화 목적 ?
[문]비동화 방법 ?
9. Coomb's test
Direct Coomb’s test
Indirect Coomb’s test
웨스턴 블롯트법(Western -blot)
1) 용도 ; 혼합단백물질에서 특이단백물질 동정
2) 단계;
① 혼합단백의 처리 : SDS(sodium dodecyl sulfate, SDS에 의해 전기적으로
중성이 되어 분석 물질의 분자량에 의해서만 전기영동됨)
② SDS-PAGE
③ gel 상의 분획단백 -->nitrocellulose 막상으로 전사
[ 시료 중(특이항체) 검출 시]
④ 시료 첨가(특이항체 포함) ; 1차 항체
⑤ 효소결합항체(방사능표지항체) 첨가 ; 2차 항체
⑥ 발색기질제, 혹은 화학발광기질제, (방사선자동사진법 autoradiography법)
⑦ 특이항체 확인 ; HIV확인검사용
FACS (유세포분석법;Flowcytometry)
(1) 용도 ; 특정 항원세포 및 세포 수, 크기, 형태 등 측정
(2) 임상적응용 ; 림프구아형검사(T,B,NK cell 등), 림프성 백혈병의 면역표지검색,
세포주기검사(세포의 DNA함량을 측정), 종양단백검출 등
(3) 유세포분석에 사용되는 측정기 ; FACS(Fluorescence activated cell sorter)
(4) 검체처리 ;
① 혈액사용
- 전혈용해제(lysing)혹은 항응고제(heparin 추천) 사용 :
(*) lysing-용액 ; ammonium chloride(NH4Cl) , ethylene glycol(C2H6O2)
- 염색과정 시 까지 실온보관(3일정도)
- 림프구 검색시; Ficoll Hypaque기법 이용 림프구분리
② 세포형광염색 ; two-color system
[형광염색물질 +단클론항체] +세포(검체)
FITC(green), PE(orange)
(5) 분석기능; analytic function
① Forward Scatter(FSC) : 1-20˚이내 각도로 산란되는 광-입자크기 관련
② Side Scatter(SSC) : 20˚이상 산란되는 광 - 90˚ light side scatter(직각분산파)
입자의 과립 정도, 내부구조관련
③ Fluorescent(FL) : 20˚이상 산란되는 광 -입자에 부착된 형광색소강도와 관련
(6) 세포분리기능
(1) 열성질환 감염 검사 - 세균 응집반응, 비동화(불활성화)
1. Widal 반응
1) 의의 - 장티프스와 파라티프스의 진단
2) 원리 - Salmonella 항원 + 환자 혈청(항체) → 응집
3) 항원
① O 항원 - Salmonella 모든 균주, 균체, 다당체, 내열성 → 현증
② H 항원 - Salmonella 모든 균주, 편모, 단백성 항원, 이열성 → 예방접종
③ Vi 항원 - S.paratyphi C, 협막성 항원 → 보균자
4) 해석
① 발병 2주까지 - 혈액검사,
2～3주 - 분변, 뇨검사,
3～5주 - Widal 반응 검사
② H 항원은 예방접종, O 항원은 현증, Vi 항원은 보균자일 경우
항체가가 높게 나타난다.
③ O 항원 응집소가 - 1:160(typhi ＆ paratyphi A) / 1:80(pararyphi B)
④ H 항원 응집소가 - 1:80(양성)
⑤ Vi 항원 응집소가 - 1:20(장티프스, 보균자)
(1) 열성질환 감염 검사 - 세균 응집반응, 비동화(불활성화)
2. Weil-Felix 반응
1) 의의 - 리켓티아성 질환 진환
2) 원리 - 변형균(Proteus)과 공통성분의 항원이 존재
→ 변형균에 대한 항체 생성
․ 변형균 항원 - Proteus OX-19, OX-2, OX-k
․ Proteus 항원 + 환자혈청(항체) → 응집
3) 해석 - 발병 2～3주경 - 항체가 상승, 4～5주경 - 항체가 최고도
① Proteus OX-19 - 1:160이상 → 발진티프스와 발진열
② Proteus OX-k - 1:160이상 → 털진드기병(쯔쯔가무시병)
③ Proteus OX-19, OX-2 → 록키산 홍반열
3. 결과 - 최종역가(항체가)는 2+의 응집을 나타낸 최고 희석배수
1) 음성 - 응집이 없음
2) 1+ - 약간 응집, 25% 정도
3) 2+ - 현저한 응집, 50% 정도
4) 3+ - 거의 완전 응집, 75% 정도
5) 4+ - 완전응집, 100% 응집
(2) Antistreptolysin O 역가 측정 (ASO, ASLO)
1) 의의 - Streptolysin O(혈구 용혈), ASO(중화, 용혈저지)
2) 원리
① Rantx-Randall 법(정량법)
혈구부유액(5%) + SLO reagent→적혈구 용혈 + 환자 혈정(ASO) → 용혈작
용 중화(감염)
② Latex 응집법(정성법)
SLO coating Latex + 환자 혈청(ASO) → 응집(감염)
3) 결과
① 1 Todd unit - 5% 혈구부유액 0.5ml를 용혈시키는 최소량의 SLO를 중화
시키는 ASLO양
② Rantz-Randall법 - 중화된 혈청의 최고 희석배수 (정상 - 0～200 Todd
unit)
③ Latex 응집법 - 응집(166 Todd unit 이상)
④ 역가 상승 질환 - 성홍열, 류마티스열, 급성 사구체 신염, 교원병, 사슬알
균 감염
(3) 결핵균 감염 검사
- 결핵균 다당체 이용 → 항체 검출, 결핵균의 활동성 및 비활동성 감별
1. Middlebrock-Dubos 반응 - 비동화
1) 의의 - 활동성일 경우 역가 상승, X-ray상 → 폐결핵과 다른 폐질환의 감별
2) 원리 - 결핵균 다당체 흡착 적혁구 + 환자 혈쳥(항체) → 응집(감염)
3) 결과 - 음성 - 1:8이하 / 급성감염-1:500이상(2주) / 1:4,000(1개월)
(4) Toxoplasma증 검사
- 원충(T.gondii)감염 질환, 뇌장애, 태생기 선천성 질환
1. 간접 적혈구 응집반응 - 비동화
1) 의의 - T.gondii를 Bis-diazotized benzudine(BDB) 처리한 면양 적혈구 이용
2) 원리 - T.gondii 감작 적혈구 + 환자 혈청(항체) → 응집(감염)
3) 결과 - 음성 - 1:8이하 / 급성감염 - 1:500이상(2주) / 1:4,000(1개월)
2. Latex 응집반응
1) 원리 - Toxoplasma coating latex 입자 + 환자 혈청(항체) → 응집(감염)
2) 결과 - 음성 - 1:8이하 / 급성감염 - 1:500 이상(2주) / 1:4,000(1개월)
(5) 매독검사
1. VDRL(Veneral Disease Research Laboratory)
1) 의의 - 간접 응집, 침강반응
Cardiolipin, Lecithin, Cholesterol
→ Kaolin or Carbonate 입자에 흡착한 지질항원 이용
2) 원리
지질항원 조성 - Cardiolipin 0.03%, Lecithin 0.18～0.3%, Cholesterol 0.9%
지질항원 + 환자 혈정(비동화) → 응집(감염) / 비응집(비감염)
3) 결과
① 정성법
․ Non-Reactive(N) - No clumping(-)
․ Weakly Reactive(WR) - Small clumping(±, 1+)★★★
․ Reactive(R) - Medium or Large clumping(2+, 3+, 4+)★★★
② 정량법(역가)
․ 정성검사 결과 Weakly Reactive 혹은 Reactive경우에 대해 행한다.
․ 응집 중 2+인 혈청의 희석배수를 역가로 한다.
반응형식
침강반응
비
항
보체결합
반응
원
매독 운동 정지시험
매독 응집 반응
독
항
원
조성
VDRL(Veneral Disease Research Laboratory)
Cardio
Kolmer의 항체 감량법, Ogata의 항체 감량법
lipin
Wasserman의 항원 감량법
Browning의 보체 증량법
Lecithi
n
Choles
응집반응
매
검사법
항원
RPR(Rapid Plasma Reagin)
TPI(Treponema Pallidum Immunobilization)
TPA(Treponema Pallidum Agglutination)
매독 형광항체 반응
FTA(Flurescent Treponema Antibody)
매독 면역점착 반응
TPIA(Treponema Pallidum Immune Agglutination)
매독균 혈구 응집반응
terol
TPHA(Treponema Pallidum Hem Agglutination)
매독 보체 결합 반응
TPCF(Treponema Pallidum Complement Fixation)
단백 보체 결합 반응
RPCF(Reiter Protrin Complement Fixation)
비병원
성
매독균
균체
성분
2. RPR(Rapid Plasma Reagin) Circle 반응
1) 의의 - 혈청과 혈장 모두 사용 (비동화 안함)
2) 원리 - 지질항원 + 환자 혈청(항체) → 응집(감염)
․ 지질항원 조성 - Cardiolipin 0.003%, Lecithin 0.02～0.022%,
Cholesterol 0.09%★★★
3. 매독 형광항체 반응(FTA)
1) 의의 - 형광색소, 특이적 검사
2) 원리 - 비병원 균주(Nichol's) 부유액, 형광 표지한 항 Human γglobulin
․ 간접법 - 항원 + 혈청(항체) → 항원-항체 복합물 + 형광 표지
항 Human globulin →형광
․ 직접법 - 항원 + 형광 표지 항 Human globulin 혈청(항체) → 형광
4. 매독균 혈구 응집 반응(TPHA, 감작 적혈구 응집반응)
1) 의의 - 비병원 균주(Nichol's)를 적혈구에 흡착, 특이적 검사
2) 원리 - 감작 적혈구 + 환자 혈청(항체) → 응집(감염)
3) 결과
① 정성법
② 정량법 - 응집이 일어난 최고 희석배수(역가)
5. Colloidal Gold test
1) 의의 - 신경계 잠입 매독 진단, 비특이적 검사
2) 원리 - Albumin ＆ Globulin 비율 변화, 10개 tube 이용
Albumin(침강 저지), Globulin(침강 유도), 침강 정도는 색깔에 의해 숫
자로 표기★★★
3) 결과 - 0～1 - non Reactive / 2～5 - reactive
① 5 - Coloreless, 완전침강
② 4 - Pale blue
③ 3 - Blue
④ 2 - Purple or lilac
⑤ 1 - Red or bluish-red
⑥ 0 - Orange-pink, 비침강
(7) B형 간염 바이러스 감염검사
․ 혈청형, DNA virus, Protein․Cabohydrate․Lipid이 주성분
․ 중심핵 - core 항원(HBc Ag)/외막 - envolpe 항원(HBe Ag)
외피 - surface 항원(HBs Ag)
1. PRHA(Passive Hemagglutination) test - 항원 이용․
원리 - 감작 적혈구 + 환자 혈청(항체, 비동화 안함) → 응집(감염)
2. PHA(Passive Hemagglutination) test - 항체 이용․
원리 - 감작 적혈구 + 환자 혈청(항체, 비동화 안함) → 응집(감염)
* 환자혈청(No virus 특이항체) +항원(virus진단용) +조류 RBC →혈구 응집→ 음성
* 환자혈청(virus 특이항체) + 항원(virus진단용) +조류RBC → 혈구응집억제 → 양성
(8) 일본뇌염 바이러스 감염 검사
- Arbovirus group, 조류의 혈구 응집
1. Heamgglutination inhibition(HI) test
1) 원리 - 일본뇌염, 인플렌자 바이러스 → 조류의 혈구 응집
․ 항원 부유액 + 환자 혈청(항체, 비동화 안함) → 응집(감염)
2) 결과 및 해석
① Single ～ 감염 - 1:320이상
② Paired ～ 감염 - 급성기 ≤ 1:40 / 회복기 1:160
(12) 면역학적 임신진단
․ 임산부 뇨 - HCG호르몬, 임신 후 40～60일 사이 최고도,
정상분만 후 1주일 이후로 소실
․ 임신 중 음성 - 태아 사망 / 분만 후 - 2～3주간 양성
→ 융모상피종, 기태(mole)
1. Immuno-plate pregnancy test - 임신 5주째부터 양성
1) 원리 - 한천평판 + 농축 가검뇨 → 둥근 환 또는 침강(호르몬 존재)
2) 결과 - 양성(양성 대조보다 약간 크거나 작은 침강환)
2. Pregnancy Slide test
1) 원리 - 항 HCG 혈청 + 환자 요(HCG) + 감작혈구(HCG) → 응집(비임
신) / 비응집(임신)
2) 결과 및 해석 - 양성-응집(비임신) / 음성 - 비응집(임신) / 임신 5주째
부터 양성
(13) C-반응성 단백 검사 (C-Reactive Protein, CRP)
․ 염증 ․ 조직 변성 ․ 괴저성 질환시 나타나는 비정상 혈청단백이다.★★★
․ 폐염구균의 균체인 C-다당체와 반응하여 침강한다.
․ 심근경색에 특이적이다
1. Capillary tube method
1) 원리 - 항 CRP 혈청(1/3) + 환자 혈청(1/3, 항체) → 흰 침강 (6～8시간 반응)
2) 결과
- 백색 침강의 양에 따라 높이를 측정/ 1+ - 1mm / 2+ - 2mm / 3+ - 3mm
2. Latex 응집반응
1) 원리 - 항 CRP 혈청(Latex) + 환자 혈청(항체) → 응집(감염)
2) 결과 - 양성(응집) / 음성(비응집)
(15) 류마티스성 관철염 검사
․ 자가항체(IgM), 사람이나 토끼의 γ-globulin과 반응★★★
1. Rapid Slide Screening 반응 (Latex Fixation test)
1) 원리 - Latex 입자(γ-globulin) + 혈청(항체, 비동화) → 응집(인자 존재)
2) 결과 ① Non-Reactive(N) - 비응집
② Weakly Reactive(WR) - 부분 or 작은 응집
③ Reactive(R) - 완전하고 큰 응집(류마티스 인자 존재)
2. Macroscopic tube 반응(역가 측정)
1) 원리 - Screening test 양성 혈청을 계대희석하여 Latex(γ-globulin)입자
첨가시 응집
2) 결과 - 양성 - 1:20 이상
3. Waaler-Rose 반응 - 분별응집비 증가
1) 원리 - 사람의 혈청 → 면양 적혈구에 대한 이종응집소 존재
① 감작 면양 적혈구(γ-globulin) + 환자 혈청 → 응집
② 무감작 면양 적혈구 + 환자 혈청(비동화) → 응집
③ 분별응집비 = 감작 혈구 응집소 역가(S) / 무감작 혈구 응집소 역가(N)
2) 결과 - 양성(응집비 1:16 이상) / 의심(응집비 1:8) / 음성(응집비 1:4 이하)
(17) Carcinoembrionic Antigen(CEA) 검출
- 대장암 및 악성종양 진단
1. EIA(Enzyme Immunoassay)★★★★★
1) 원리 - 고상법(B/F 분리 필요), 항원 검출
․ 항 CEA 항체 bead + 혈청→미반응 물질 세척→ peroxidase 표지 항 CEA
항체(2차반응)
→ 비반응 peroxidase 세척 → OPD(Orthphenylenediamine) →
bead(yellow-orange색깔)
→ 발색 정도를 492nm에서 측정
2) 결과 - 표준용액으로 만든 표준곡선과 조합해서 검체 중의 농도를 산출
한다.