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1) Southern blotting

DNA분자를 Agrose gel로부터
membrane으로 옮긴 후, 특정 DNA
서열(sequence)을 probe(탐침)을 이
용하여 탐지하는 방법.
2) Northern blotting

Southern blotting과 같은 원리이며
DNA 대신 특정한 RNA를 탐지하는
방법.
3) Western blotting

Immunoblotting이라고 하기도 하며 항원-항체 반응을 이용하여 여러 단백
질 혼합물 중에서 원하는 특정 단백질만을 찾아내는 방법.

원하는 단백질에 대해서 높은 특이성을 가진 항체가 필요하다.
1) Western blotting
2) 면역조직화학(Immunohistochemistry)
3) 효소결합면역흡수분석법(ELISA-Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
4) 면역퍼옥시다제 세포 염색법(Immunoperoxidase cell staining)
5) 면역형광 세포 염색법(Immunofluorescnce cell staining)
6) 면역침강법(Immunoprecipitation)
7) 유세포분석기(Flow cytometry)


전기적으로 분리된 단백질을 membrane으로 transfer하여 확인하는 방
법으로 주로 단백질이 갖고 있는 antigenic epitope와 특이하게 반응하
는 항체를 이용.
방사선동위원소로 표지 되지않은 복잡한 형태의 단백질 중에 특이한 단
백질을 확인하고 정량 하는데 유용.
1) 장점
 특정 단백질의 항원성을 통
해 확인가능.
 단백질의 분자량 확인 가능.
 소량의 단백질도 확인 가능.
2) 일반적인 blotting 실험 방법
 시료준비
 겔 전기영동(gel eletrophoresis)
 transfer to membrane
 blocking
 항체부착
 detection(검출)
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

Southern blot : DNA detection
Northern blot : RNA detection
Western blot : Protein detection
-단백질을 크기별로 분리하는기술. 항원-항체반응을이용하여전체단
백질에서 특정단백질만을 Detection 할수있다.
-sample(Total protein)을SDS-PAGE를 이용해 분리하고, 이 단백질을
membrane에 옮기는과정을 거쳐 항원-항체반응을 시켜 발광을유도
함으로써검출한다.
①Protein size별분리(SDS)
②항원-항체반응
③Detection (HRP-Luminol,ECL)

gel 내부의 단백질은 항원이 결합 할 수 없으므로 항원이 결합 할 수 있는
membrane으로 size 별로 분리된 단백질을 그대로 이동 시키는 과정.
*Transfer buffer
 20% 메탄올(methanol) : membrane에 단백질 결합능력(binding capacity)이 증가.
*Membrane을 사용하는 이유?




항체를 이용하여 확인할 때 더 편리하다.
겔을 다루는 것 보다 편리하다.
염색(staining/destaining)이 빠르다.
장기간 보관에 용이하다.
*Transfer membrane의 종류 및 특징

단백질의 transfer 되지 않는 부분이 다른 단백질로 오염되거나 antibody가
붙을 수 없도록 skim milk나 BSA등으로 block 해주는 과정
*Common membrane blocking reagents
Reagent
Formulation
Comments
Dried milk
5 % non-fat dried milk in PBS or TBS
Masks some antigens
Milk/Tween-20
5 % non-fat dried milk in PBS or TBS, 0.1 % Tween-20
Masks some antigens
Tween-20
0.1 % Tween-20, 0.02 % NaN3 in PBS or TBS
Can stain after detection
BSA
0.3–3 % bovine serum albumin, 0.02% NaN3 in PBS
Lower endogenous cross-reactivity
5) Wash

Western blotting은 여러 가지 연속적인 과정을 거치는데 이 때 비특이적
결합을 최소화해 주기위한 과정이다.
장점
단점
-1가지 항체만 이용하므로 빠름.
직접방법
(Direct
method)
-2 차
항체의
교차반응
-표지물질(label)을 1차 항체에 결합시 항
(cross- 체의 면역반응(immunoreactivity)감소.
reactivity)를 고려하지 않아도 됨.
-가격이 비경제적.
-1차항체에 대한 표지(label)가 이중으 -신호(signal)가 거의 증폭되지 않음.
로 가능.
-1차 항체 표지물질의 선택폭이 적음.
-2차 항체가 신호를 증폭시킴.
-여러 종류로 표지된 2차 항체를 이용
할 수 있음.
간접방법
(Indirect
method)
-한 종류의 2차 항체를 여러 종류의 1
차 항체에 이용가능.
-표지능(labeling)이 1차항체의 면역
반응(immunoreactivity)에 영향을 끼
치지 않음.
-2차 항체에 따라 발현방법(detection
method)을 다르게 할 수 있음.
-2차 항체는 비특이적 염색(nonspecific
staining)이 나타날 수 있음.
-직접방법보다 추가적인 단계가 있음.
*항체 –항원과 결합하는 단백질을 말하며, 혈액과 체액에 녹아있는immunoglobulin
(Ig)을 지칭. (단일클론항체, 다클론항체)
*1차 항체(primary antibody)


membrane에 붙어있는 단백질 중에 확인하고자 하는 단백질의 항원을 인식하므
로 항원 특정 부위에 결합.
적절한 희석이 중요 - 원하는 단백질을 특이적으로 확인 할 수 있으며 비특이적
결합은 최소화하는 범위.
*2차 항체(secondary antibody)
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


1차 항체를 인식하여 결합.
1차 항체에 대하여 종(species) 특이적으로 준
비.
e.g) rabbit 1차항체 -> goat-anti rabbit 2차
항체
일반적으로 HRP(horseradish peroxidase)나
AP(alkaline phosphatase)같은 reporter
enzyme을 포함.
*항체 (antibody )표기방법
1.
2.
3.
4.


Host : antibody를 어디서 만들었는가. Antibody가 생산된 동물.
Anti-Target gene
Ig type
conjugate name(옵션 - 보통 2차 항체 있음)
1차 항체를 표기하는 방법
ex) 마우스에서 만든 actin을 잡는 항체 중 IgG type
= Mouse anti-actin IgG
2차 항체를 표기하는 방법
ex) 염소에서 만든 항체 중 mouse actin을 잡는 IgG type인데 HRP conjugation
= Goat anti-mouse actin IgG (HRP)
*확인방법(Detection method)
발색(Chromogenic, Colorimetric)
repoter enzyme
기질(substrate)
HRP
(Horseradish peroxidase)
반응결과
DAB(3,3'-diaminobenzidine)
갈색.
(니켈(Ni)이나 코발트(Co)이
온 첨가시 민감도가 상승)
TMB(3,3'5,5' tetramethylbenzidine)
청색
4CN(: 4-chloro-1-naphtol)
청색/흑색
AP
BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-ind
(Alkaline phosphatase)
olyl phosphate/nitroblue tetrazolium)
청색/흑색
화학발광(Chemiluminescent)
HRP
AP
Luminol
light, glow or flash
Dioxetene-phosphate
light, glow

발색법: 신호가 착색된 침전물형태로 형성.

화학발광법: 반응결과 빛을 방출.


BCIP는 AP에 의해 가수분해되어 인디고
염색(indigo dye)을 만드는 이합체화 반응
(dimerization)을 하는 중간체
(intermediate)를 형성한다.
NBT는 이합체화 반응에 의해서 산화되어
NBT-formazan으로 바뀐다.
실험결과
Pre-stained
Protein size marker
CBB staining
WB
ECL
NBT/BCIP
 동영상 : https://www.youtube.com/watch?v=uFu8aie4QFI
 https://www.youtube.com/watch?v=mjbr3beDslo