Transcript 전기 영동 -> 증폭 DNA 확인

 Contents
1. 실험 목적
2. 실험 배경 이론
3. 실험 원리 및 방법
4. 실험 결과 및 분석
5. 실험 오류 원인 분석
6. 참고문헌
1. 실험 목적
염색체 DNA 분리 및 정제 과정 이해
실험에서의 시약과 Enzyme작용 이해
PCR과 전기영동법에 대한 이해와 장치의
조작 방법 습득
2. 실험 배경 이론
DNA란 ?
Deoxyribonucleic acid
유전형질을 전달하는 유기화학적 분자구조
단위체: 뉴클레오티드
A-T, G-C의 상보적 결합
RNA란 ?
Ribonucleic acid의 약자
세포내 단백질의 합성에 관여
2. 실험 배경 이론
_DNA 분자구조
Hydrogen bonding
DNA 3차원구조
RNA3차원구조
3. 실험 원리 및 방법
PCR 이용한 DNA 증폭
전기 영동 통해 증폭 DNA 확인
3. 실험 원리 및 방법
 실험 시 주의사항
• 피펫 사용에 주의를 기울인다.
->실험 결과에 직접적인 영향을 미칠 수 있기 때문.
특히, 추출과정에서 sample에 시약을 첨가할때
나 gel에 DNA를 주입할때 주의한다.
• 전기 영동시 EtBr은 발암물질이므로 주의한다.
• UV광학기 사용시 자외선을 눈으로 직접 쬐지 않
도록 주의한다.
 그람 양성/ 음성
실험에서 사용한 세균 : 대장균
그람 음성균
그람 양성균
(자주색)
그람
세포벽 두껍다
세균
염색
그람 음성균
(분홍색)
세포벽 얇다
●그람 양성균
<바실러스균>
<비브리오균>
<포도상구균>
●색소나 약재에 대한 감수성이 높음
●대사작용에 아미노산과 비타민을 필요로함
●그람 음성균
<대장균>
<살모넬라균>
<이질균>
●색소에 대한 저항력이 강함
●생존에 필요한 영양요구가 간단하여 단순한 구성의
배양액에서도 잘 자람
3. 실험 원리 및 방법
PCR (Polymerase chain reaction)개요
원리: primer를 이용하여 원하는 DNA부분
을 짧은 시간 동안에 수십만 배로 증폭.
과정(3단계)
Primer의
열변성
단일사슬
결합
DNA합성
신장 반응
3. 실험 원리 및 방법
DNA이중 나선 구조가 풀림
Primer가 주형 DNA에
상보적으로 결합
Taq 중합효소에 의해
DNA합성 시작
결합온도(Tm) = (4 × [G+C]) + (2 × [A+T])℃
3. 실험 원리 및 방법
3. 실험 원리 및 방법
 PCR 이용한 DNA 증폭
100
Denaturation
5분
90
온
80
Polymerization
도
5분
70
℃
이상의 3단계 과정을
60
통해 원하는 부분을
annealing 1
분
50
1
2
3
4
5
6
7
8
시간 (분)
수만배 증폭
9
10
11
12
13
14
15
3. 실험 원리 및 방법
 PCR 이 쓰이는 분야
•
•
•
•
•
•
에이즈 유발하는 HIV유전물질 감별할때
유전이 원인이 되는 질병을 진단할때
미라의 DNA를 감별할 때
식품에 서식하는 병원성 미생물의 검출때
바이러스 감염의 초기 식별때
기타 범죄수사나 법의학, 의학, 유전공학, 분자
생물학 등에도 쓰임.
3. 실험 원리 및 방법 _전기 영동 -> 증폭 DNA 확인
Agarose-gel을 만들고 EtBr 가함
홈에 ladder와 DNA(+dye) 삽입
전기 영동 실시
UV광학기 통해 확인
*EtBr : Etidium Bromide,
평면구조, 발암물질
->DNA의 이중나선 사이에
끼어들어,UV 비추면 형광 발산
3. 실험 원리 및 방법
 전기 영동법(Agarose-gel)
• 전기 영동에 필요한 세가지 성분
① 전하를 띤 입자(charged particle)
② 전장(electric field)
③ 이동이 일어날 수 있는 medium->Agarose gel
• DNA 분자 : 음전하, linear
=> 전기장에서 양극으로 이동
4. 실험 결과 및 분석
 전기 영동으로 확인할 수 있는 것
띠가 나온 위치를 분석
띠의 선명도를 분석
상대적인
분자량의 크기와
정량을 파악할
수 있다!
4. 실험 결과 및 분석
glda
mgsa
3. 실험 원리 및 방법
• 전기영동시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들
1) DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동
※ DNA분자의 크기 증가 할수록
①DNA 분자의 net electric charge가 증가 -> 이동속도 증가
②DNA 분자(linear)와 Agarose-gel 과의 마찰력이 증가 -> 이동속도 감소
=> ①<②이므로 이동속도 감소
2) Agarose-gel 농도가 높을수록 느리게 이동
3) 부하되는 전압이 높을수록 빠르게 이동
4. 실험 결과 및 분석
gldA보다
mgsA의 band가
더 아래쪽에
위치해 있다.
전기영동에서
분자량이
작을수록
이동도가 더
크다.
mgsA의
분자량이
gldA보다 더
작다.
4. 실험 결과 및 분석
 띠의 선명도 비교
Band가 더 밝다
DNA의 양이 많다.
4. 실험 결과 및 분석
□실험오류
5. 실험오류원인 분석
 오류 원인
순수한 agarose 가 아닐 가능성.
Taq 효소나 Primer 가 잘못되었을 가능성
젤의 홈 안으로 들어 가는 액체의 부족
피펫 사용에서 실수 하였을 가능성
5. 참고문헌
1) Biochemistry, Campbell Farrell, Fifth edition, p215~326
2) Gene cloning, T.A Brown 2001 p28~51
3) www.cafenaver.com /biotechcyberlab
4) 유전공학, Watson, 탐구당, 1994, p87~91
5) Gene cloning, T.A Brown, 2001, p185~186
6) 분자생물학 박상대외 6명 로욜라도서관 572.8 w 363 K
7) www.ncbi.nim.nih.gov
Thank you!!