Transcript Transcription

분자생물학
From DNA to Protein
By 배형섭
핵산의 구성 단위
핵산은 인산과 당을 포
함하고 있을 뿐만 아니
라 puerine계 2가지 화
합물
Adenine A, Guanine G
 pyrimidine계
Cytosine C, Thymine T,
Uracil U(RNA의 경우)
을 포함한다.
Nucleotide
DNA분자 내에서 인
산 분자, 당 분자, 염
기 하나가 모여 단위
를 구성(이것들이 모
여서 핵산을 이룬다)
DNA의 간단한 구조
왼쪽 그림에서와 같이
DNA는 염기의 수소결
합에 의한 2중 나선 구
조를 하고 있는데
AG의 이중결합과 CG
의 삼중결합으로 붙어
있다.
EXON & INTRON
 원핵 생물처럼 핵이 없는 생물은 DNA의
유전암호가 전부 읽혀지는데 반해 포유동물
같은 진핵 생물은 유전 정보가 띄엄띄엄 읽
혀지게 된다.
 정의: intron은 암호화하지 않는 부분으로
그 유전자의 정보가 무엇이든 단백질을 합
성하지 않는 유전자 서열이고 exon은 암호
화하는 부분으로 그 유전자의 정보에 따라
단백질을 합성하는 유전자 서열임.
• 진핵 생물의 게놈에는 단백질을 만드는 유전자 서열에 intron이 기
능이 없는 비암호화서열이 중간 중간에 끼여 있다. 즉 exon은 intron
에 의해 몇 조각으로 나누어 져 있다.
• intron을 제거하고 exon을 이어 붙이는 과정을 splicing이라 함.
• 진화과정 중 intron을 경계로 하여 독특한 기능적 영역을 암호화하
는 exon들이 다양하게 조합되어 새로운 기능을 보유하는 다양한 단
백질을 지배하는 유전자들이 탄생되었다고 추정 중.
RNA
RNA의 종류(3가지)
• 1. mRNA(messenger RNA
전령 RNA):
RNA polymerase에 의해
DNA(원본)의 한쪽을 풀어 그 염
기에 대응해 DNA의 유전정보를 충
실히 전달한다.(RNA에서는 T대신 U
가 대치된다.)
• DNA는 중요물질이기 때문에 핵
밖에 나갔다가 리소좀에 의해 분해
될 수 있기 때문에 전령인 RNA를
만들어 보내는 것이다.
이 과정을 전사(Transcription) 라
한다.
• RNA 중합효소가 처음에 와
서 붙는 위치를 프로모터라
고 부른다. (promoter)
•
DNA복제나 RNA전사시
모두 5’말단->3’말단방향
으로 진행된다. (여기서
5’는 핵산의 당의 5번탄
소의 인산기이며 3’은 핵
산의 당의 3번탄소의 OH
기 이다)
• 2. tRNA(transfer RNA):
세포핵 내에서 합성된
mRNA는 핵 막의 핵공을
통해 세포질로 이동하여
리보솜에 부착하는데
이때 tRNA가 아미노산
특이성에 따라 특정
아미노산과 결합하여
리보솜에 부착되는 것이다.
간단히 말해 tRNA는
mRNA에서 온 염기서열에 대
응하는 아미노산으로 바꾸어
주고 이동시켜주는 통역
(translation)역할을 하는 것이
다.
•
3. rRNA(ribosomal RNA)
단백질이 합성되는 세포 내 소기관인 리보솜(ribosome)을 구성하는 물
질. 리보솜에서 아미노산들이 폴리펩타이드 결합으로 단백질이 된다.
rRNA는 mRNA가 리보솜에 잘 붙을 수 있도록 도와주는 역할을 한다.
RNA를 거침으로써 얻어지
는 이익:
1) DNA가 핵 밖으로 나갈
필요가 없다. (진핵 생물
의 경우)
2) 염기 서열의 일부만 발현
된다. (발현 시기와 상대
적 양 및 효율의 조절)
mRNA의 3조 암호문
• 염기 3개가 1개의 아미노산을 지정하며, 이를 코돈 (codon)이라 함
RNA는 단일 가닥으로
존재하기 때문에 다양
한 방식으로 접혀서
독특한 3차 구조를 가
진다.
이러한 성질 때문에
정보 저장 이외에도
여러 기능을 수행 할
수 있다.
(=ribozyme.Splisosom
e이 대표적인 예)
Transcription은 DNA 이중 나선 중 한
가닥 (=sense strand)을 주형으로 하여
일어난다.
염색체상에서 주형으로 쓰이는 가닥은
유전자마다 각기 다르다. ( 따라서 전사
방향 역시!)
실제로 만들어진 RNA 산물의
염기서열은 전사되지 않는
가닥(=antisense)과 동일하다.
Antisense RNA/DNA 는 자연적 또는
인위적으로 세포내 유전자 발현 조절에
이용된다.
RNA 중합효소는 DNA복제 떄 여러 다른 효소에 의하여 수행되던 기능을 모두
담당할 수 있다.
하나의 유전자에서 전사가 완결되기 전에 다시 앞쪽에서부터 전사가 시작되기도 한다.
활발하게 합성되는 종류의 단백질 유전자에서 특히 그러함.
아래 그림: 인접한 rRNA 유전자의 동시다발적 전사.
(note) rRNA와 tRNA는 그 자체가 최종산물이며 단백질로 만들어지지 않음.
(=so called Non-Coding RNA, 최근 rRNA와 tRNA 이외에도 많은 종류가 새롭게 발견됨.
핵과 세포질의 구별이 없는 원핵세포에서는 심지어 전사가 완결되기도 전에 그
시점까지 만들어진 RNA가닥에 ribosome들이 달라붙어 단백질 합성을 시작하는
경우도 있다.
Transcription
Similarity between replication and transcription
Both processes use DNA as the template
 Phophodiester bonds are formed in both
cases.
 Both synthesis directions are from 5 to 3
Template and Enzyme
The whole genome of DNA needs to be
replicated, but only small portion of genome is
transcribed in response to the development
requirement, physiological need and
environmental changes.
DNA regions that can be transcribed into RNA
are called structural genes
Template
The template strand is the strand from
which the RNA is actually transcribed. It is
also termed as antisense strand.
 The coding strand is the strand whose base
sequence specifies the amino acid sequence
of the encoded protein. Therefore, it is also
called as sense strand
Asymmetric transcription
 Only the tempate strand is used for the
transcription, but the coding strand is not.
 Both strands can be used as the templates.
 The transcription direction on different strands
is opposite.
 This feature is referred to as the asymmetric
transcription.
Transcription process
RNA polymerase (an enzyme) attaches to
DNA at a special sequence that serves as a “start signal”.
The DNA strands are separated and one strand serves
as a template.
 The RNA bases attach to the complementary DNA
template, thus synthesizing mRNA.
The RNA polymerase recognizes a termination site on the
DNA molecule and releases the new mRNA molecule.
Eukaryotic Transcription
Stages of Transcription -Initiation
Initiation
Stayes put for a bit
• Nucleoside triphospates (NTPs) are added one by one
until 9 bp have been added, and then elongation can
occur (i.e. RNApoly can move)
RNA Polymerase
 The enzyme responsible for the RNA synthesis
is DNA-dependent RNA polymerase.
 The prokaryotic RNA polymerase is a
multiplesubunit protein of ~480kD.
 Eukaryotic systems have three kinds of RNA
polymerases, each of which is a multiple-subunit
protein and responsible for transcription of different
RNAs.
RNA-pol of Prokaryotes: Holoenzyme
The holoenzyme of RNA-pol in E.coli consists of 5 different subunits:
• Rifampicin, a therapeutic drug for tuberculosis
treatment, can bind specifically to the subunit of RNApol, and inhibit the RNA synthesis.
• RNA-pol of other prokaryotic systems is similar to that
of E. coli in structure and functions
RNA-pol of eukaryotes
RNA-pol
Products
Sensitivity
To Amanitin
I
45S Rrna
No
II
hnRNA
high
Amanitin is a specific inhibitor of RNA-pol.
III
5SrRNA
tRNA
snRNA
moderate
Three RNA polymerases
•
•
•
•
One for each major type of RNA
RNApoly I makes pre-rRNA
RNApoly II makes pre-mRNA
RNApoly III makes pre-tRNA
Each polymerase has a different promoter
structure
RNApoly II promoter
•
•
•
•
Initiator sequence surrounding the start point
TATA box at about –25 bp
TATA+Initiator = core promoter
A transcription factor binds to the TATA box before
RNAPoly II
Bacterial Promoters
•
•
•
•
A promoter is where RNApoly binds
Template strand versus Coding strand
Upstream – in the 5’ direction on the coding strand
Consensus sequences
Transcription factors
• A basal transcription factor is
always required to allow
RNApoly to bind to DNA
• For RNApoly II, TFIID binds
to the TATA box. This is the
basal transcription factor.
• More TFs bind to TFIID
through protein-protein
interactions to form the
preinitiation complex.
• Then RNApoly binds
• Many TFs may be involved
Recognition of Origins
• Each transcriptable region is called operon.
• One operon includes several structural
genes and upstream regulatory
sequences (or regulatory regions).
• The promoter is the DNA sequence that RNA-pol can
bind. It is the key point for the transcription control.
Promoter
• regulatory
• sequences structural gene
Prokaryotic promoter
Promoter
•
•
•
•
•
5’
RNA
3’
Regions of similarity are found around 10 and 35 bases before the start
site of transcription:
DNAse protection shows that RNA polymerase can bind to these same
regions.
Mutations of these sites can lead to the elimination or reduction of
transcriptional initiation at a promoter.
Differences in these sites control the relative rates of expression of
different genes.
Strong promoters have sites that are very similar to the consensus
sequence while weak promoters show many differences
Consensus Sequence
• The -35 region of TTGACA sequence is
the recognition site and the binding
site of RNA-pol.
• The -10 region of TATAAT is the region
at which a stable complex of DNA and
RNApol is formed.
Transcription Process
General concepts
• Three phases: initiation, elongation, and
termination.
• The prokaryotic RNA-pol can bind to the
• DNA template directly in the transcription
process.
• The eukaryotic RNA-pol requires cofactors
to bind to the DNA template together in
the transcription process
Transcription of Prokaryotes
• Initiation phase: RNA-pol recognizes
the
promoter and starts the transcription.
• Elongation phase: the RNA strand is
continuously growing.
• Termination phase: the RNA-pol stops
synthesis and the nascent RNA is
separated from the DNA template.
a. Initiation
• RNA-pol recognizes the TTGACA region,
and slides to the TATAAT region, then
opens the DNA duplex.
• The unwound region is about 17 1 bp
• The first nucleotide on RNA transcript is
always purine triphosphate. GTP is more
often than ATP.
• The pppGpN-OH structure remains on the
RNA transcript until the RNA synthesis is
completed.
• The three molecules form a transcription
initiation complex.
• No primer is needed for RNA synthesis.
• The subunit falls off from the RNA-pol
once the first 3,5phosphodiester bond
is formed.
• The core enzyme moves along the
DNA template to enter the elongation
phase.
b. Elongation
• The release of the subunit causes
the conformational change of the
core enzyme. The core enzyme slides
on the DNA template toward the 3 end.
• Free NTPs are added sequentially to
the 3-OH of the nascent RNA strand.
(NMP)n + NTP (NMP)n+1 + PPi
RNA strand substrate
elongated
RNA strand
• RNA-pol, DNA segment of ~40nt and
the nascent RNA form a complex called
the transcription bubble.
• The 3 segment of the nascent RNA
hybridizes with the DNA template, and
its 5end extends out the transcription
bubble as the synthesis is processing.
R가 terminator에
결합
Transcription bubble
5’-capping과 poly(A) tail 의 기능
-Protection from degradation
(due to longer half life---think maternal transcripts)
-방향 표지
-Translation 조절에 관여
(고도로 분화된 진핵 생물 유전자 발현 조절의 한 단면)
MIT의 Phil Sharp가 진핵생물의 intron을 발견한 공로로
1994년 Nobel 상 수상.
Why intron??
-때로는 유전자 발현 조절에 관여
-제한된 숫자의 유전자를 다양하게 이용 할 수 있음
(differential splicing)
snRNPS (small nuclear ribonucleoprotein particles) ,
작은핵 RNA (snRNA)와 단백질의 복합체
“Splisosome”을 형성한다.
RNA가 효소 작용을 하는 ribozyme의 대표적인 예.
Other ribozymes:
ribonuclease P
ribosomal large subunit (28S rRNA)
many more to come
Splicing
Exon and intron
Exons are the coding sequences that
appear on split genes and primary
transcripts, and will be expressed to
matured mRNA.
Introns are the non-coding sequences
that are transcripted into primary
mRNAs, and will be cleaved out in the
later splicing process.
Splicing mechanism
Trans-splicing
Spliceosome
• Splicing introns from mRNA occurs at
short, conserved sequences called splice
sites which specify the beginning and
ends of introns.
• GU on the 5' end and AG on the 3' end
are 100% conserved.
• Catalyzed by a structure called a
spliceosome, composed of protein and
RNA (snRNA – small nuclear RNA)
Three classes of RNA splicing
Converting Group I introns into ribozymes
RNA-RNA hybrids during splicing
Errors by mistakes in splice-site
selection
The AT-AC spliceosome catalyzed
splicing
Alternative splicing
전사 (transcription)
DNA-dependent RNA polymerase의 작용으로
DNA를 주형으로 RNA 가닥을 합성하는 과정.
rNTP를 building block으로 사용하며 연결 과정에서
PPi가 빠져 나오는 것, 그리고 새로운 사슬의 합성이
5’ 3’으로 진행되는 것은 DNA복제와 마찬가지.
DNA 복제 ( replication) 과의 차이점:
-두 가닥의 주형 DNA 중 한 가닥만 읽는다
(만들어진 산물도 외가닥)
- 일부 지역만 읽는다
(만들어진 산물의 길이가 짧다)
- Thymine이 올 자리에 대신 uracil이 들어간다.
- 선도 사슬이 필요없이 끝자리에서부터 시작 할 수 있다.
- 교정 작업 (proof reading) 을 하지 않는다.
왜 우리는 실제 주형과 상보적인 가닥을 읽을까?
Transcription, 그 중에서도 mRNA의 합성 과정에 관한 분자생물학적 지
식들은 먼저 간단한 대장균을 통하여 밝혀짐.
DNA에 부착하여 RNA 를 합성하고
있는 대장균의 RNA 중합효소
( 2 a + b + b’ ) + s
-core enzyme (핵심효소)
-holoenzyme (전효소)
유전자가 앞쪽에 s-factor 가 달라
붙는 부위가 있어 그 바로 뒷부분에
서부터 전사가 시작된다..
Alias “TATA” box
진핵생물에서는 위치가 일정치 않음
TTGACA
TATAAT
RNA 합성의 4 단계
1)
2)
3)
4)
개방 복합체의 형성
개시 (initiation)
사슬의 연장 (elongation)
종결 (termination)
1) Open-promoter complex
DNA 복제의 경우 helicase가 담당하는 작업.
RNA 전사때에는 RNA polymerase가 primerase + helicase 의 역할
도 담당. 전사가 시작될 부위를 인지하는 것은 s-factor.
2) Initiation
항상 그런 것은 아니지만 주로 A 또는 G 에서 시작된다.
3) Elongation
RNA 중합효소 복합체가 한 자리씩 옮겨 가면서 새로 들어오는 rNTP
를 이제 까지 만들어 진 사슬에 붙여 나간다.
( next slide)
진핵 세포의 RNA는 합성 후 핵에서 공정 단계를 거치고 난 뒤 세포질로
방출된다. (5’-capping, 2nd 염기의 methylation, polyadenylation, splicing)
5’-capping과 poly(A) tail 의 기능
-Protection from degradation
(due to longer half life---think maternal transcripts)
-방향 표지
-Translation 조절에 관여
(고도로 분화된 진핵 생물 유전자 발현 조절의 한 단면)
INTRON
MIT의 Phil Sharp가 진핵생물의 intron을
발견한 공로로
1994년 Nobel 상 수상.
Why intron??
-때로는 유전자 발현 조절에 관여
-제한된 숫자의 유전자를 다양하게 이용
할 수 있음
(differential splicing)
snRNPS (small nuclear ribonucleoprotein
particles) ,
작은핵 RNA (snRNA)와 단백질의 복합체
“Splisosome”을 형성한다.
RNA가 효소 작용을 하는 ribozyme의 대표적인
예.
Other ribozymes:
ribonuclease P
ribosomal large subunit (28S rRNA)
many more to come
Translation
단백질 합성의 세 기구:
1) mRNA-the template
2) tRNA-the delieverer
3) rRNA (ribosome)-the
synthesizer
1) mRNA
1950년대 말 까지 DNA가 일단 RNA로 전사 된 뒤 이로부터 단백질이
합성된다는 것에는 의견이 모아짐.
The question is HOW?
RNA(=핵산)의 언어가 단백질의 언어로 바뀌는 과정은 일종의 암호해독
(deciphering)을 필요로 한다.
Code – coding – triplet codon
하나의 아미노산을 stand for 하는 핵산이 세 개 (triplet codon)이라는
것을 어떻게 알아내었나??
핵산의 종류는 4개. 아미노산의 종류는 20개.
if mono-codons: 가능한 아미노산의 종류는 only 4 개.
if doublet –codons : 가능한 아미노산의 종류는 4 X 4 = only 16 개
따라서 최소한 3개의 핵산이 하나의 아미노산을 암호화 해야 함.
2) tRNA
tRNA는 mRNA를 해독하면서 해당 아미노산과 연결해주는 adapter 이다.
약 80 nt로 이루어진 작은 RNA 가닥.
2차구조로 clover leaf모양을 형성하며 두 개의 leaf가 겹쳐서 다시 L자 모양.
두가닥을 이루지 않는 두 부위중 하나는 RNA상의 triplet codon과 결합하는
anticodon, 그리고 다른 하나는 해당 아미노산이 부착되어 있는 자리이다.
각각의 tRNA에 누가 지정된 amino acid를 붙여주나?
각 amino acid 마다 정해진 aminoacyl – tRNA – synthetase가 있다.
모두 20개.
Anticodon과 아미노산 수용기 팔의 염기서열을 보고 판독.
따라서 translation 과정에서 이 효소의 정확도는 매우 중요.
(A number game)
20 aminoacyl-tRNA synthetase
31 tRNA
61 (64-3 stop) codon
이것은 한 synthetase가 하나 이상의 tRNA를, 그리고 한 tRNA가 여러 개의
codon을 인지 할 수 있음을 보여준다.
tRNA의 구조상 anticodon의 첫번째 (=codon의 세번째) nucleotide는 완벽한
수소결합이 형성되지 않아도 좋다.
따라서 codon의 세 번째 자리에 약간의 변이가 허용됨. (=wobble)
바로 이 현상 때문에 많은 자연발생적 점돌연변이가 치명적인 결과를 가져오지
않고 넘어갈 수 있다.
또한 한 aminoacid에 배당되는 염기서열이 두 개 이상인 것도 이 현상으로 설
명된다.
(p. 241 그림 21 다시보기)
3) rRNA (ribosome) 실제로 단백질의 조립이 일어나는 공장.
Some ribosomes are free.
Some are bound to the ER.
진핵생물의 ribosome은 세포질에서 합성된 rProtein이 핵으로 들어가 rRNA
와 조합된 뒤 다시 세포질로 나와서 활동.
원핵생물은 large, small subunit가 모두 조금씩 작다.
원핵생물의 ribosome large subunit를 형성하는 rRNA (23S + 5 S. 진핵생물의
경우는 세 개의 28S rRNA.)
그림에서 보듯이 ribosome의 large subunit는 RNA (not protein) 이 전체적인
모양을 결정하며 peptide bond를 형성하는 기능도 담당한다.
 A Ribozyme.
3. Termination
Shine-Dalgarno (SD) sequence : AGGAGGU
5’-cap이 없는 원핵생물은 어떻게 단백질 합성을 시작하나?
각 ORF 의 앞쪽에 위치한 SD를 16S rRNA가 인지하고 부착한다.
원핵생물의 rRNA small subunit도 initiator tRNA를 장착하고 다님.
단 이 경우는 보통 Met가 아닌 fMET. 왜일까??
Polyribosome 또는
polysome
진핵과 원핵생물에 모두 존재.
단 원핵생물에서는 mRNA가 아
직 DNA에 붙어있는 상태에서
polysome이 형성된다.
진핵생물과 원핵생물의 단백질 합성 과정에서 찾을 수 있는 세부적인
차이는 인간에게 편리하다.
e.g. 원핵생물의 단백질 합성만을 저해하는 인자를 사용하면 우리 몸
의 세포에는 해를 주지 않으면서 감염된 병원균만을 죽일 수 있음.
이것이 바로 항균제, 또는 항생제 (antibiotics).
알려진 대부분의 항생제는 원핵생물의 단백질 합성단계중 하나를 저
해한다.
(p. 252 표 7-2)
곰팡이나 균류, 또는 원생동물 (공통점: 진핵생물!)이 일으키는 질병을
치료하기 어렵고 또한 이들을 죽이기 위하여 사용되는 약물이 환자에
게 고통을 주는 이유는??
합성된 단백질의 분해
세포내에서 만들어진 단백질을 신속히 분해해야 하는 경우들이 있다.
-특정 상황에서만 필요한 단백질 (세포주기 조절인자, 신호전달물질)
-잘못 접힌 단백질 이를 위하여 전문적인 분해 장소 (=proteasome) 가
존재.
Ubiquitin 에 의한 단백질 분해 (ubiquitin-dependent proteolysis)는 가장 대
표적인 단백질 분해 기구 .
합성된 단백질의 분해
세포내에서 만들어진 단백질을 신속히 분해해야 하는 경우들이 있다.
-특정 상황에서만 필요한 단백질 (세포주기 조절인자, 신호전달물질,
etc)
-잘못 접힌 단백질
이를 위하여 전문적인 분해 장소 (=proteasome) 가 존재.
Ubiquitin 에 의한 단백질 분해 (ubiquitin-dependent proteolysis)는 가장
대표적인 단백질 분해 기구 .
The RNA-World Hypothesis
Idea의 저장
매개자
Idea의 실행
RNA world 가설을 지지하는 실제 증거들
1. RNA가 DNA보다 먼저 만들어졌다?
-핵산의 모든 염기 (아데닌, 구아닌 시토신)은 각기 고유의 생합성
과
정을 거치는 반면 유독 티민만은 우라실의 methylation을 통하여 만들
어 진다.
- 프라이머가 있어야만 하는 DNA 중합효소와는 달리 RNA중합효소는
새로운 가닥을 시작할 수 있다.
2. 실제 RNA가 유전물질로 작용할 수 있다
현재도 일부 바이러스는 RNA를 유전 물질로 사용한다.
RNA virus중 retrovirus는 어쩌면 유전정보의 저장 기능이 RNA에서
DNA로 이양되는 과정을 보여주는 중간단계가 아닐런지?
3. RNA가 단백질의 역할을 맡는다는 증거
- 핵 속에서 여러 가지 작은 non-coding RNA들이 intron의 제거, mRNA의
변형과 교정, 그리고 telomerase에 의한 말단 연장에 사용된다.)
- Ribosome 내에서 아미노산과 아미노산 사이의 peptide결합은 rProtein이
아니라 rRNA에 의하여 촉매된다.
- RibonucleaseP는 tRNA의 전구체를 잘라서 완성된 형태로 만들어준다.
2) RNA can
modify other RNA
3) RNA can catalyze its own synthesis
여러 가지 non-coding RNA
RNA
능
rRNA
합성
tRNA
이름
기
ribosomal RNA
단 백 질
transfer RNA
아미노산 운반
snRNA
small nuclear RNA
snoRNA
small nucleolus(인) RNA
processing
aRNA
antisense RNA
발현 조절
miRNA
micro RNA
발현 조절
siRNA
small interfering RNA
splicing
RNA
유 전 자
유 전 자
유전자 발현 조절
유전자에서 단백질까지 요약1
유전자에서 단백질까지 요약2