Transcript 2. 구제역 혈청학적 예찰의 이해.

백신
구제역
예찰
방역
국내 구제역 혈청학적 예찰의 이해
농림축산검역본부 구제역진단과 탁동섭
목차
A. 구제역이란
1. 구제역 바이러스
2. 구제역 임상증상
B. 구제역진단법
1. 구제역 진단
C. 구제역 혈청예찰
1. 예찰개요
2. 통계예찰
3. 목적예찰
4. 백신(SP)항체
A. 구제역이란
1. 구제역 바이러스
2. 구제역 임상증상
구제역
1. 구제역 바이러스
1. 구제역 바이러스
구제역 바이러스 분류
• 피코르나바이러스과(Picornaviridae) 아프토바이러스속(Aphthovirus)
• 그리스어로"(Aphtha-, vesicles in the mouth”, 영어로Foot and Mouth Disease(FMD)로 명명
구제역 바이러스 모양
• 외가닥의 (+) RNA, 직경 : 22~25 nm
• 정십이면체 형태로 4개의 구조단백질(VP1, VP2, VP3, VP4)로 구성
구제역 바이러스 종류(혈청형)
• 7 혈청형(serotypes) : A,O,C,Asia1, Sat1-3(교차면역은 형성되지 않음)
• 국내 주 발생 혈청형은 O, A
1. 구제역 바이러스
O형 : 프랑스 Oise Valley 지역 (1922)
A형 : 독일이라는 의미의 프랑스어 Allemagne 에서 유래
(1922)
C형 : 독일에서 발생, 세번째 구제역 혈청형 (1926)
SAT 1-3 : 아프리카 지역 발생 (1948)
Asia 1 : 인도, 아시아 최초 발생 (1951)
1. 구제역 바이러스
1. 구제역 바이러스
사람의 호흡기 및 공기를 통한 전파 가능성
인체의 호흡기계 1-2일간 생존가능(적절한 온습도 유지시)
 구제역바이러스 노출시 3-5일간 가축접촉 금지/샤워·의류교환·침뱉기
공기전파 : 육지60㎞, 바다 250 ㎞(Donaldson et al. 1982)
구제역 감염동물[잠복기, 임상증상 발현]
돼지-하루 최대 108.6 TCID50 배출 (소 등 반추류 보다 1,000-3,000배 이상 배출)
감염동물의 타액, 분변 및 뇨, 우유, 정액 등이 주 감염원, 감염고기 및 부산물
 축종별 carrier 상태 지속 기간
Carrier
- 소(Cattle) 대개 6개월이내(최대 3.5 years까지 가능)
- 양(Sheep)
9 동물의
months
바이러스가
감염된
인두중앙부위(oropharynx)에서 28일간 이상 존재
- 염소(Goat)
4 months
 감염된 동물의 15-50%가
carrier로 남음 (백신접종여부와무관)
- 버팔로(Buffalo) 5 years
(S. Alexandersen et al.2002 )
1. 구제역 바이러스
2. 구제역 임상증상
2014/2015 구제역 감염축의 주요 임상증상
2. 구제역 임상증상
소의 주요 증상
돼지의 주요 증상
B. 구제역의 진단 및 예방
1. 구제역 진단
2. 구제역 예방
3. 구제역 백신
구제역
1. 구제역의 진단
구분
항체진단
항원진단
시험법
시험방법
Liquid Phase Blocking (LPB) ELISA
WRL Pirbright UK
NSP 항체 ELISA
메디안디노스틱, 바이오노트, 프리오닉스
바이러스 중화시험(VNT)
IBRS-2
Penside(NSP)
피비엠이스트
바이러스 분리동정(Virus Isolation test)
ZZR, IBRS-2, BHK
RT-PCR, Real-time PCR, Typing PCR
Using primers for IRES and 3D region
항원(Antigen) ELISA
WRL Pirbright UK
Pen-side(SP/ NSP)
PBM east
※ 항원(Antigen) : 생체 내에 투여하면 이것에 대응하는 항체(抗體)를 혈청 속에 생성시켜 생체내에서나
시험관 내에서 그 항체와 특이적으로 반응하는 성질을 가지는 물질
※ 항체(Antibody) : 바이러스, 세균등 항원을 비활성화시키고 신체에 침입한 미생물에 대항하여 세포외부
자극을 유도하는 당단백질이다
구제역 실험실 진단절차
Report of suspicious case by regional office
2-8 hrs
Dispatch of QIA sampler to suspect farm
Rapid antigen test (30min)
(vesicular samples)
Sample collection
Rapid antibody test (30min)
(If need)
Arrival in QIA
 antibody test
4-20 hrs
 antigen test
 NSP ELISA (4 hrs)
for infected antibody
 SP ELISA (5~20 hrs)
: FMD Serological test
Simultaneouly
 RT-PCR (5 hrs)
 Antigen ELISA (8 hrs)
need minimum 8 hrs after receiving the samples
Negative
VN test (96hrs)
Positive
Sequencing (24hrs)
Typing of Serotype and Genetic type
15
구제역 항체 검사법
SP ELISA
NSP ELISA
• 구조단백질에 대한 항체
검사법
• 감염 4-7일내 항체 검출
• 혈청형(7종)별 검사
• 백신축과 감염축 감별불가
• 백신접종 현황 조사
• 비구조단백질에 대한 항체
검사법
• 감염 7-10일내 항체 검출
• 모든 혈청형 검사
• 백신축과 감염축 감별
• 구제역 발생(유행)상황 조사
구제역바이러스 유전자 지도 및 단백질(구조, 비구조) 구성
P1
P2
Protease
Protease
Protease
Helicase/
ATPase
Capside
VPg (3B)
P3
VPg
precursor
RNA
Polymerase
3’ UTR
5’ UTR
Lpro
VP4
VP2 VP3
VP1
2A
2B
2C
3A
3B
3C
3D
Poly(A)
ORF
S-Fragment
IRES
PKs
Poly C
Cre
1.3 kb
7 kb
90 nt
?
Polyprotein
Lab/Lb
VP4
VP2 VP3
L
VP1
P1/2A
2A
2B
2C
3A
3B
P2BC
VP3
VP1
VPO
3D
P3
Lpro
2B
2C
3A
3BCD
3AB
3C
구조단백질(SP)
3C
3CD
3D
비구조단백질(NSP) : 바이러스 증식시 발현
2A
3C
Liquid Phase Blocking ELISA (LPB ELISA)
HRP
Rabbit anti GP
conjugated with HRP
- 진단시간 (약 2 일)
- 숙련된 실험자 필요
GP anti FMDV
- 불활화된 구제역바이러스 사용
FMDV antigen +
antibody mixture
Rabbit anti FMDV
SP ELISA (Ceditest FMDV type O)
양성
불활화 구제역바이러스
음성
구제역바이러스에 대한 항체
HRP 결합 구제역바이러스에 대한 단크론항체
SP ELISA (Ceditest FMDV type O) 결과 정의
PI값 (percentage Inhibition) 이란?
- 반응억제도/판정기준값
- 항체검사킷트 제조사 (PrioCHECK사, 스위스/
네덜란드 제조)에서 정한 구제역 항체 양성/음성
을 판정하는 기준
- PI 50 이상은 검사혈청에 구제역바이러스에
대한 항체가 존재함을 의미함
- PI= < 50% (음성), ≥ 50% (양성)
NSP
NSP
NSP
450nm
NSP
FMDV NSP 코팅
비발색: 양성
검사 혈청
구제역 바이러스에 대한 항체
NSP
발색: 음성
단크론항체 (HRP 결합)
다른 항원에 대한 항체
HRP가 결합된구제
역바이러스에 대한
항체
Test procedure (Median diagnostics, Prionics)
HRPO
Y
Y
YY Y
Recombinant
3AB/ 3ABC Antigen
YY Y
Y
+
Add sample
Add conjugate
*60 min at RT(Median)
60 min. RT
*O/N at RT(Cedi NS)
HRPO
YYY
-
Test procedure (Median diagnostics, Prionics)
Y Y Y
TMB
No Color :
Positive
Incubation
15 min.
Room Temp.
TMB
Stop &
Reading
Wash & Substrate
450nm
Color :
Negative
Y Y Y
Test procedure (Bionote)
Y
Y YY
HRPO
Recombinant
3ABC Antigen
Adding of Undiluted
serum, Conjugate
YYY
Y
Y
+
Incubation
90 min. 37℃
HRPO
YYY
Y
-
Test procedure (Bionote)
Y Y Y
15 min.
Room Temp.
Deep yellow
TMB
Positive
Stop &
Reading
Wash & Substrate
Incubation
Slight yellow
TMB
Negative
Y Y Y
SP/NSP 항체 검사 결과 판독
ELISA
결과 해석
SP ELISA/ VNT
FMDV NSP Antibody
양성
양성
감염
양성
음성
백신접종
음성
양성
비특이반응
음성
음성
음성
Mab conjugated with gold
particle
FMD NSP specific Mabs
FMD SP specific Mabs
Polyclonal rabbit anti-mouse Ig
FMDV SP
FMDV NSP
30분 반응
Reservoir Pad
Wicking Membrane
Absorbent Pad
(Buffer Application) (Nitrocellulose membrane)
Manisa
Asia 1
A
C
C. 구제역 혈청예찰
1.
2.
3.
4.
개요
통계예찰
목적예찰
백신(SP)항체
구제역
1. 구제역 혈청예찰 개요
구제역 예찰이란?
Passive surveillance
구제역 의심 신고축에 대한 조사
Active surveillance
구제역 발생가능성을 확인하기
위한 적극적인 조사 및 감시활동
임상예찰 : 농가 및 도축장 가축에
대하여 구제역 증상 조사
혈청예찰(NSP 항체) : 통계/목적예찰
혈청예찰(SP 항체) : 백신항체형성률 조사
1. 구제역 혈청예찰 개요
통계예찰
• 구제역 청정국 지위획득을 위한 통계자료 확보 등
(NSP)
전국 소, 돼지, 염소 대상 무작위 혈청검사 실시
목적예찰
• 통계예찰 보완책으로 시·도가축방역기관·검역본부
(NSP)
백신항체 예찰
(SP)
의뢰검사, 도축장 NSP 및 역학주요대상인 종돈장,
야생동물, NSP 양성축 추적검사 등 실시
• 농가·개체별 백신 항체양성률을 조사, 구제역 백신
접종실시 여부 모니터링
1. 구제역 혈청예찰 개요
구제역 혈청예찰 물량(SP/NSP)
연도별 구제역 혈청예찰 실적
292,811
291,946
300,000
244,690
250,000
213,281
200,000
150,000
110,211
110,639
132,409
130,600
100,000
단위: 두수
2. 통계예찰
선정된 농가내의 개체 단위 선정
축종별 유병률(소10%, 돼지20%, 염소10%)를 산입한
농가당 유효검사두수: 소4두, 돼지 12두, 염소4두
권역별(중부권, 충청권, 전라·제주권, 경상권) 무작위추출
염소는 채혈이 어려워 전국단위 추출
진단법민감도:95%신뢰수준95% 농가간 유병율1%농가내 유병률 10%
국내 가축사육규모를 토대로 통계학적으로
유의적인 검사개체수 산정
3. 목적예찰
의뢰
검사
종축개량 등 시도자체계획에 따라 실시하는 혈청검사
도축장
NSP
종돈장
야생
동물
도축장 출하돈에 대한 혈청검사
구제역 발생시 주요 전파원이 될 수 있는 종돈장에 대해
종돈장 방역관리요령에 따라 구제역 혈청검사 실시
구제역 주요 발생원 및 전파원이 될 수 있는 야생동물(야생멧돼지, 고라니 등)에
대한 구제역 혈청검사 실시
NSP양성축
추적검사
2011년~ NSP 양성축에 대한 추적검사(연2회) 실시
3. 목적예찰
검사항목
검사기관
시도가축방역기관
의뢰검사
검역본부
종돈장
시도가축방역기관
검역본부
검사두수
비고
15,370 시도 자체 계획 의거 (종축개량 등)
1,300 종축장 물량 1,530두 포함
32,118 종돈장 방역관리요령에 의거
480 바이러스과 야생멧돼지 시료활용
야생동물
시도가축방역기관
NSP 항체양성축
추적검사
시도가축방역기관
합계
*도축장 NSP예찰 제외
87 시도 자체 계획 의거
2,465 동일개체에 대하여 연 2회 검사 (상반기, 하반기)
51,820
3. 목적예찰
구분
검사 절차 및 대상
최초 양성 확인
통계예찰, 목적예찰 등
전체 임상검사
농장내 전두수 임상검사, 증상 발현 및 항원 검출시 방역조치
① 소․사슴․염소 : 전 두수 NSP검사
1
1차 확대검사
② 돼지 : 돈사별 16두 이상 NSP검사
이동제한 대상
해당 농가 전두수
③ (공통) 항원검사: NSP 양성축 및 동거축, 환경 시료
(공통) 긴급백신접종, 발생농장에 준하는 소독 및 세척
2차 확대검사
2
(바이러스순환검사)
-1차후 3주 경과
음성전환축 확인검사
3
(최종확인검사)
-2차후 3주 경과
① 소․사슴․염소 : 1차 확대검사 NSP 양성축 + 동거축 16두 이상
② 돼지 : 1차 확대검사 NSP 양성축 + 동거축 16두 이상
③ (공통) 항원검사: NSP 양성축 및 동거축, 환경 시료
해당 농가 전두수
※ 2차 확대검사 이상없으면 NSP양성축 제외하고 이동제한 해제
① 음성 전환축(2차검사에서 음성개체)에 대한 NSP 검사
② 음성 전환축의 동거축 검사 (16두)
③ 음성 전환축 및 환경 항원검사
NSP 양성축
※ NSP 및 항원검사 음성시 개체표시 관리후 이동제한 해제
* 농장내 NSP 양성축이 증가, 항원이 검출되지 않을 경우 전두수 검사 및 추적조사를 통한 원인규명 (항원검출시 즉각 방역조치)
* 이동제한기간 중 농장이동 금지, 도축장 출하허용, 조기도태장려금 지원
4. 백신(SP)항체
백신항체 형성률이란?
구제역 백신 항체형성률의 조사
모니터링
•
소(도축장/농가): 유병율80%, 정밀도5%, 신뢰도95% 수준으로 산출시 농가당
1두 검사 : 음성시 (PI≤50) 확인검사
•
돼지: 번식(농가, 년3회)/비육(도축장/농가) 각각 농가당 3두/10두
번식 1두 이하(60% 미만), 비육은 2두 이하(20% 이하) 양성시(PI≥50)확인검사
•
염소(농가) : 동일기준 산출시 농가당 4두 2두 이하 양성시(PI≥50) 확인검사
확인검사 : 모니터링 검사결과에 따라 농가당 16두 검사
(과태료 기준 : 소 80% 미만, 번식돈 60% 미만, 비육돈 30%미만)
의뢰검사 : 농장주 등의 요청에 따라 검사실시
4. 백신(SP)항체
소
100.0
75.0
100.0 100.0
번식돈
비육돈
염소
100.0
93.7
95.3
94.6
94.5
93.2
95.8
92.1
91.6
91.5 92.4
90.5
88.2
88.4
84.7
86.8
86.4
86.3 86.4 84.6
85.3
83.7
84.5
82.1 80.5 81.5
81.3 82.2 82.2 80.6
80.3 79.0
78.5 79.4
75.0
79.2
84.1
73.1
72.1
98.7
96.7
96.7
95.6 96.7
95.4 94.6 94.4
95.7
95.1 93.9
86.8 86.4 85.5 85.9
82.8 84.1
81.0
63.9
65.4 64.7 66.2 64.0 64.4
59.5
50.0
56.9
51.9
50.7
43.9
46.0
42.1
40.6
42.4
40.2
52.5
59.7
49.9
43.6
37.0
25.0
14년 2월 3월 4월 5월 6월 7월 8월 9월 10월 11월 12월 15년 15년 15년 15년 15년 15년 15년 15년
1월
1월 2월 3월 4월 5월 6월 7월 8월
구제역 백신연구센터
(사업기간) 2013년~2015년
(사업예산) 246억(국비)
(사업규모) 연6,294㎡


백신제조용 종독개발을 위한 차폐시설(BL3)
동물시험(소, 돼지)이 가능한 백신효능평가시설(ABSL3)
국내 분리 O 혈청형 종자바이러스 개발(13)
구제역 O, A, Asia1형 3가 백신 개발 추진중 (14~)
백신의 접종반응 최소화를 위한 피내접종법 연구(13~16
바이러스의 배양, 정제, 정량법 연구(11~)
<지하> 시설관리실 <1층> BL3/KVGMP
<2층> 일반실험실
<3층> 공조실
국산화를 통한 구제역 백신 안정적 확보 및 수입 대체
한국형 백신개발 • 적용으로 백신방어 효율성 제고 및
구제역 조기 청정화 구현
구제역백신 연구센터 투시도
(김천 혁신도시)
감사합니다