Transcript 1

1
Gene Expression ใน Eukaryotic Cells

Control โดย
Spatial & Temporal regulation
 Transcriptional control ของ DNA
 Alternate splicing ของ RNA
 Cytoplasmic control ของ mRNA stability
 Induction ของ transcriptional activity โดย
environment และ biological factors

2
Spatial & Temporal Regulation
Spatial regulation: การแสดงออกของ genes แตกต่ างกัน
เนื่องจากความจาเพาะของ เนื้อเยื่อ (tissue-specific
expression) gene product ทุกอย่ างไม่ เป็ นทีต่ ้ องการของ
ทุกเนื้อเยื่อ
 Temporal regulation: การแสดงออกของ genes ในเวลาที่
แตกต่ าง แล้ วแต่ สิ่งกระตุ้น หรื อช่ วงพัฒนาการ

3
Transcriptional control ของ DNA ~ RNA polymerase &
promoter
 Alternate splicing ของ RNA ~ การตัดต่ อ RNA เต็มวัย
(maturation ของ RNA)
 Induction ของ transcriptional activity ~ อุณหภูม,ิ แสง,
hormones ชักนาให้ genes แสดงออก โดยเฉพาะระหว่ าง
พัฒนาการ (development)

4
Cytoplasmic control ของ mRNA stability
mRNA ถูกสลายง่ าย จึงต้ องมี transcription เพิม่ อยู่
ตลอดเวลา
 polypeptides ทีเ่ ป็ นผลผลิตของ gene จะหยุดการ
สั งเคราะห์
 polypeptides ทีม
่ มี ากเกินไปจะเป็ นผลร้ ายกับเซลล์
 การสลาย (degradation) mRNA จึงป้ องกันการแสดงออก
ของ genes
 mRNA stable โดย Poly-A tail และ Estrogen
 mRNA ถูกสลายถ้ ามี 3’ untranslated sequence
AUUUA ซ้าหลายครั้ง

5
Transcriptional in Eukaryotes
Factors สาคัญคือ
1. RNA Polymerases
2. Promoters
3. Transcription Factors
4. Enhancers
5. Upstream promoter elements
6
1. RNA Polymerase
RNA polymerase ใน Eukaryotic cell มี 3 types คือ
RNA Pol I ใช้ สังเคราะห์ rRNA precursor (18S + 28S +
5.8S)
RNA Pol II ใช้ สังเคราะห์ mRNA precursor
RNA Pol III ใช้ สังเคราะห์ tRAN precursor และ
5S rRNA precursor
 RNA polymerase ทั้ง 3 ชนิดของ eukaryote ไม่ มี

 s factor
– structure ต่ างกัน
– จา promoter ต่ างกัน
7
2. Promoter

Promoter สาหรับ RNA Polymerase แต่ ละชนิด ต่ างกัน
ที่


Element(s) ซึ่งเป็ น ลาดับพิเศษบน DNA หรื อเป็ นตาแหน่ งที่
RNA polymerase จาได้ (recognition site) ในการเข้ ามาจับที่
promoter เพื่อการ control ต่ างกัน
ดังนั้น RNA polymerase แต่ ละชนิดมี promoter เฉพาะ
8
3. Transcription Factors

Transcription factor หรื อ TF ช่ วยการทางาน
ของ RNA Polymerase อย่ างถูกต้ อง เช่ น
TATA-binding protein (TBP)
 TFIIA --> TFIIH


โดยจับบน DNA ที่
DNA binding domain และ
 Transcription activation domain

9
4. Enhancers and Silencers


เป็ นส่ วนของ DNA ทีช่ ่ วย stimulate transcription จาก
promoter แต่ ไม่ เป็ นส่ วนของ promoter
จัดเป็ นความสั มพันธ์ โดยระยะทางบน DNA (fixed
spatial relationship)ในการ control genes อาจพบอยู่
ได้ หลายตาแหน่ งบน DNA
10
Enhancer & Silencer
11
5. Upstream promoter elements
เป็ น binding site สาหรับ transcription factors ของ
RNA polymerase II
 ไม่ เป็ นส่ วนของ promoter

12
Control ของ RNA Polymerase I
สาหรับ rRNA (18 S, 28 S และ 5.8 S)
Promoter: มีส่วนควบคุม (control element) อยู่ที่ 2 blocks คือ
1) Core element (Core) :
position ระหว่ าง - 45 ถึง +20 สาหรับ RNA Polymerase
2) Upstream control element (UCE) :
position ระหว่ าง -156 ถึง -107
เพื่อให้ transcription มีประสิ ทธิภาพ
 ทั้ง 2 blocks ไม่ ปรากฎมี consensus sequence
13
RNA Pol I Promoter
Human rRNA promoter:
RNA Polymerase I จับที่ -45 (downstream) ถึง +20
(upstream)
 TIF-I จับที่ -67 (downstream) ถึง -14 (upstream)
 ดังนั้น RNA Pol I - TIF-I complex จับบน promoter
sequence ที่ -67 ถึง +20

14
Control ของ RNA Polymerase II
Promoter: มี control element 2 แบบ แล้ วแต่ genes
1. TATA box หรื อ Hogness box ที่ -25
มี consensus sequence คือ TATAAAA
ต้ องการ upstream promoter element 21 bp
(เป็ น 3 repeats) ระหว่ าง -40 และ -103
2. CAAT box
consensus sequence (GC)CCAATCT ที่ -75
15
Control Elements ของ RNA Polymerase II Promoter
16
Initiation complex
ของ RNA
polymerase II
 ต้ องการ TBP และ
TFII A --> H

17
Enhancer ของ RNA pol II:
 Stimulate transcription จาก promoterไม่ มี consensus
sequences
 เป็ น tissue-specific เช่ น mouse immunoglobulin
enhancer แสดงออกใน immunoglobulin genes ในเซลล์
immune system แต่ ไม่ แสดงออกใน mouse connective
tissue cell
Enhancer
Closed promoter
18
Enhancer

Enhancer ช่ วย
RNA polymerase
เปิ ด promoter จึง
เกิด transcription
Opened Promoter
19
Control ของ RNA Polymerase III
Promoter: เป็ น Internal promoter
 5S rRNA gene promoter:
มี control element upstream และระหว่ าง +55 ถึง +80


tRNA gene promoter
มี 2 blocks แยกกัน A block ระหว่ าง +8 ถึง +30 และ
B block ระหว่ าง +51 ถึง +72
20
21
Posttranscriptional Control in Eukaryote



RNA ที่ สร้ างได้ ใหม่ ใน nucleus เรียกว่ า Primary
transcript
ยังไม่ แปรรู ปใช้ งานไม่ ได้ จะมีความยาวมาก
Primary transcript หรื อ precursor ของ mRNA
เรียกว่ า Heterogeneous nuclear RNA (hnRNA)
22
Heterogeneous nuclear RNA (hnRNA)
23
mRNA Processing

hnRNA จะต้ องถูก modified ต่ อไปด้ วย 3 ขั้นตอน
คือ
1. Capping
2. Tailing
3. Intron Splicing
24
1. Capping

การแปรรู ปทีป่ ลาย 5’ โดยเติม Cap ซึ่งเป็ น 7methylguanosine
ป้องกันถูกย่ อยโดย nuclease
 ให้ ribosome จา mRNA ได้ และ
 การขนส่ ง mRNA ออกจาก nucleus ไป cytoplasm

Guanine triphosphonucleotide
(GTP) จับที่ nucleotide ปลาย 5’
 Guanine (G) ถูกเติม CH3(methyl) เข้ าที่ N7 ของโมเลกุล

25
Capping & Methylation
26
Capping Reaction
27
2. Tailing

กระบวนการเติ่ม Adenine จานวนมากเข้ าทีป่ ลาย 3’ end
(trailer) ของ hnRNA เรียกว่ า Polyadenylation

โดย poly-A polymerase

เพื่อ stability และ transportation RNA ออกจาก nucleus
28
Tailing ของ mRNA
29
3. Intron splicing


Primary transcript ของ mRNA, tRNA และ rRNA มี
ส่ วนเกินทีจ่ ะถูกตัดออกก่ อน ให้ เป็ น mature RNA จึง
ทางานใน cytoplasm ได้
ส่ วนเกิน หรื อ noncoding sequence เรียกว่ า Intron อยู่
ระหว่ าง coding sequences ซึ่งเรียกว่ า Exon
30
31
mRNA
Splicing
32
Intron แบ่ งเป็ น 4 กลุ่ม
1. Group I intron : intron มี 5’ UA และ 3’ G

nuclear rRNA precursor และ mitochondrail rRNA
2. Group II intron : intron มี 5’ G และ 3’ ANn-G

mitochondrial mRNA precursor
3. Nuclear mRNA intron : intron มี 5’ G และ 3’
UACUAAC box (TACTAAC box บน DNA)

mRNA precursor ใน nucleus ของ eukaryotes
4. tRNA intron : ลักษณะเฉพาะตัว
33
Mechanism ของ Splicing
1. Self splicing โดย Autocatalytic property of intron เอง
1.1 ต้ องการ Guanine-containing nucleotide
(GMP, GDP, GTP) พบใน group I introns
1.1 ไม่ ต้องการ Guanine-containing nucleotide
พบใน group II introns
34
2. Spliceosome: ต้ องการ snRNA เป็ นเอนไซม์ ตัด
และมี proteins เป็ นส่ วนประกอบ รวมเรียกว่ า
small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs)
หรื อ Snurps หรื อ Spliceosomes พบใน mRNA
precursor
3. tRNA precursor splicing: ใช้ Splicing
endonuclease และ Splicing ligase
35
Self-splicing ของ Group I intron
ต้ องการ Guanine
36
Self-splicing ของ Group II intron
ไม่ ต้องการ Guanine
37
Spliceosome
ต้ องการ
Snurps โดย
snRNA มี
enzyme
activity
(Ribozyme)
38
Alternative Splicing ของ mRNAs
การตัด Introns หรื อ ต่ อ Exons อย่ างสลับของ mRNA
precursor
 ในบางกรณี Splicing site ที่ 5’ และ 3’ บน intron อาจ
เปลีย่ นได้ ทาให้ gene 1 gene สามารถให้ mRNA หลายแบบ
เป็ น Family ของ mRNAs
 นั่นคือ 1 gene สามารถ code ให้ protein ได้ หลายแบบทีค
่ ลาย
กันมาก ซึ่งเรียกว่ า Protein Isoforms
 เช่ น Immunoglibulin genes code ให้ antibody หลายชนิด

39
Alternate
Splicing
40
tRNA Splicing
Splicing endonuclease ตัดปลายทั้ง 2 ข้ างของ intron
 Splicing ligase ต่ อปลายของ 2 exons เข้ าด้ วยกัน

41
42
Reverse transcription
สั งเคราะห์ DNA โดยใช้ RNA เป็ นแม่ แบบ และ
ใช้ RNA-dependent DNA polymerase หรื อ
Reverse transcriptase (RT)
DNA ทีไ่ ด้ เรี ยกว่ า Complementary DNA (cDNA)
RNA tumor virus เมื่อเข้ าไปในเซลล์ จะสร้ าง cDNA ก่ อน
แล้ วจึงต่ อ (integrate) เข้ า DNA ของ host และ
cDNA สามารถสั งเคราะห์ จาก mRNA ได้ ในหลอดแก้ ว
(in vitro)

43
Reverse Transcription
44
Mechanism ของ Reverse Transcription
45
Central Dogma Update
V.
1
V. 2
V. 3
V.
4
(forbidden)
46