Transcript Transcription

Transcription
1
Transcription
การถ่ายทอดข้อมูลพันธุกรรม (information)
จาก double-stranded DNA โมเลกุลให้ไป
อยูใ่ น single-stranded RNA โมเลกุล
หรื อเป็ น กระบวนการสร้างสาเนา (copy)
RNA ของ gene หรื อเรี ยกว่า
RNA synthesis
2
Transcription
เป็ น gene expression ระดับหนึ่ง โดยการ
ถอดรหัส sequences ของ base pairs เฉพาะ ที่
เรี ยกว่า Gene (structural gene) ซึ่งอยูใ่ นรู ปของ
DNA ให้ไปอยูใ่ นรู ปของ RNA
หรื อเท่ากับเป็ นการถอดรหัสของ DNA information
จากภาษา nucleotide เดิม คือ
ภาษา DNA ให้อยูใ่ น
ภาษา RNA
3
Link ระหว่าง Transcription & Translation
4
1. Factors ของ transcription
2. Direction ของ transcription
3. Mechanism ของ transcription
4. Control ของ transcription ใน Prokaryotic cells
5. Control ของ transcription ใน Eukaryotic cells
6. Mechanism ของ RNA splicing
7. Reverse transcription
5
Factors สาคัญใน Transcription
1. DNA template เพียง 1 strand รี ยกว่า
Template strand
strand ตรงข้าม เรี ยกว่า Nontemplate strand
RNA จะเหมือน nontemplate ยกเว้น U แทน T
กรณี mRNA จะเรี ยกว่า Sense strand ซึ่ง base ตรงกับ
nontemplate strand จึงใช้ลาดับ base ของ strand นี้
เขียนเป็ นลาดับ base ของ gene
Gene ใดๆบน DNA ที่จะถูก transcribed ต้องมี 3
ส่ วนสาคัญตามลาดับคือ
promoter…...structural gene…….terminator 6
Template and Nontemplat strands
7
2. RNA polymerase เป็ น holoenzyme
ประกอบด้วย 2 components หลัก คือ
- Sigma (s) factor สาหรับ start transcription
- Core polymerase สาหรับ unwind DNA template
และใส่ nucleotides เริ่ ม และตลอด transcription
มี 4 subunits คือ
- 2 a subunits
- 2 b subunits
8
RNA polymerase ไม่สามารถทาหน้าที่
proofreading ความถูกต้องของ nucleotides ที่
ใส่ เข้าในกระบวนการ ซึ่งไม่วกิ ฤต เพราะRNA
มีอายุส้ นั มีจานวนหลาย copies และสร้างใหม่
ได้เร็ ว
9
3. Promoter เป็ น regulatory sequence บน
DNA และเป็ น signal สาหรับ initiation และเลือก
ว่า DNA strand ใดจะถูก transcribed Promoter
เป็ น binding site ของ RNA polymerase เมื่อ start
transcription
Transcription
จะประสบผลสาเร็ จหรื อไม่
ขึ้นอยูก่ บั promoter
เป็ นอย่างมาก
10
4. Terminator เป็ น sequenceให้ signal หยุด
transcription
Terminator site เป็ น inverted repeat sequence
บนทั้ง DNA template และ
RNA ที่สร้างได้
- บน DNA form เป็ น
Cruciform structure
- บน RNA form เป็ น
Stem-loop structure
กอน
base ตัวสุ ดท้ายจะถูก
่
transcribed
11
เป็ นที่จบั ของ protein พิเศษ เช่น rho (r) หรื อ
NusA protein
RNA polymerase จา termination site ได้ ทาให้
RNA polymerase หลุดออก DNA template หยุด
transcription
12
Direction ของ Transcription
ทิศทาง growth ของ RNA เป็ น 5’ ---> 3’ โดย
nucleotides โมเลกุลใหม่จะถูกนาไปต่อเข้าที่ 3’ ของ
nucleotides ที่มีอยูแ่ ล้ว
ในขณะเดียวกัน RNA polymerase จะ unwind DNA
ไปทาง upstream [nucleotide (-) ก่อน start point]
แล้ว DNA template ที่ถูก unwind ไว้เดิมจะ rewind
กลับคืน
13
upstream
start point
downstream
-1 +1
Direction of
transcription
14
Mechanism ของ Transcription
1. Initiation
2. Elongation
3. Termination
15
Initiation
ต้องการ Promoter และ RNA polymerase
RNA polymerase จับ promoter บน DNA ซึ่ง
เป็ น consensus sequences และ upstream (-)
แล้วจัดให้ s factor อยูต่ รงตาแหน่ง start
point (+1) จากนั้น core-RNA polymerase
ใส่ nucleotide ตัวแรกที่ start point
เมื่อเริ่ มได้แล้ว s factor จะ release ออกจาก
promoter
16
Initiation of transcription
Holoenzyme จับที่
closed promoter แล้ว
แยกDNA ออกเป็ น
opened promoter
พร้อมเคลื่อนที่ไปมา
จน sigma factor
อยูท่ ี่ start point
ภายหลัง initiate แล้ว
sigma จะหลุดออก
17
Elongation
RNA polymerase จะนา nucleotides โมเลกุลอื่นๆ เข้า
ต่อที่ 3’ - OH free end ของ nucleotide มีก่อนแล้ว
และ ต่อเข้าไปเรื่ อยๆให้ได้ RNA สายยาวจาก 5’ ---> 3’
RNA ที่ synthesis ได้ใหม่คงทา complementary อยูก่ บั
DNA template
ส่ วน RNA ช่วงที่ synthesis ได้ก่อนจะหลุดออกจาก
template
18
Elongation of transcription
คงเหลือแต่ core enzyme ของ holoenzyme
RNA polymerase ที่ทาหน้าที่สงั เคราะห์
RNA ต่อไป
19
Termination
เมื่อ RNA polymerase ทางานมาถึง terminator
transcription จะหยุด
Terminator มี 2 types คือ
1) Rho - dependent terminator
2) Rho - independent terminator
Terminator ทั้ง 2 types เหมือนกันคือ มี
inverted repeat sequence บน DNA และ RNA
20
1) Rho-dependent terminator
Rho [ r ] เป็ น hexamer protein ที่เหมือนกันทั้ง 6
copies
Rho จับ และ เคลื่อนที่ไปบน RNA จนทันกับ RNA
polymerase ที่ terminator ทาให้หยุด transcription
โดยไม่ให้ RNA polymerase readthrough terminator
21
2) Rho-independent terminator
หยุด transcription โดยไม่มี rho protein
ที่ Termination site :
บน DNA มี base A มาก
บน RNA มี base U มาก
หลัง stem-loop
ทาให้ได้การจับของ A-U base pairs ไม่แข็งแรง จึง
stable น้อย เป็ นผลให้ RNA และ RNA polymerase
หลุดออกจาก DNA หยุด transcription
22
RNA Script
RNA ที่ transcribed ได้ใหม่ซ่ ึงยาวกว่า gene ปกติ
1. 5’ leader segment ส่ วน translation initiator
2. Gene หรื อ Protein-coding sequence เริ่ มที่ AUG
ซึ่ง เป็ น initiation codon ใน translation
3. 3’ trailer segment หรื อ poly A สาหรับrecognition และ stability ของ mRAN กับ ribosome
23
Transcriptional Control in
Prokaryotes
24
Transcriptional Control in Prokaryotes
1. Binding RNA Polymerase to Promoter
RNA polymerase เป็ น Holoenzyme จับกับ promoter
อย่างแข็งแรงมาก
2. Operon
Biochemical pathway ที่ตอ้ งใช้ enzymes เป็ น group
Genes สาหรับ proteins ที่ function ด้วยกันจะ ถูก
controlled ด้วยกันเป็ น group อย่างต่อเนื่อง และ
ประสานกัน เรียกวา่ Operon
25
1. Binding RNA Polymerase to Promoter
Promoter มี recognition sites ซึ่ง เป็ น conserved และ
consensus ประมาณ 12 base pairs แยกเป็ น 2 sites คือ
1) Pribnow box มี 6 bp คือ TATAAT อยู่
upstream ต่อ start point และอยู่ ติดกับ base
-10
2) -35 sequence มี 6 bp คือ TTGACA อยู่
upstream และอยูต่ ิดกับ base ที่ -35
26
2. Operon unit ของ gene expression และ regulation
ใน bacteria ประกอบด้วย structural genes และ
regulatory gene(s) ใน DNA ซึ่ง structural gene ถูก
recognized โดย products ของ regulator gene(s)
Operon สาหรับ catabolic enzyme - lac operon
สาหรับ anabolic enzyme - trp operon
27
lac operon
โดย
Jacob & Monod, 1940’s
28
lac operon
3 genes code ให้ 3 enzymes สาหรับ lactose
metaboliom เรี ยงตามลาดับ
lacZ code ให้ b-galactosidase
lacY code ให้ galactoside permease
lacA code ให้
galactoside
transacetylase
ทั้ง 3 genes transcribed จาก 1 promoter
(บน DNA)
และอยูบ่ น mRNA
เดียว
นัน่ คือ 1 mRNA carry หลาย genes / messages29
30
lac operon มี regulatory site 2 sites ซึ่งอยูต่ ิดกันคือ
1. Promoter สาหรับ RNA Polymerase
promoter แบ่งเป็ น 2 ส่ วน
right promoter
left promoter
2. Operator สาหรับ repressor
31
1 Negative control ของ lac Operon
operon turn on
ยกเว้นมี บางอย่างมา
torn off
1.1 Repression : operon turn off
เลี้ยง E.coli ใน glucose และ lactose
Repressor
จาก lacI gene จับกับ Operator
RNA Pol ไม่จบั promoter--> ไม่มี transcription
ไม่มี mRNA ไม่มี enzymes ทั้ง 3 ไม่ใช้ lactose
E. coli ใช้ glucose เป็ นแหล่งพลังงาน 32
Repression (turn off) เมื่อไม่ตอ้ งการใช้ lactose
33
1.2 Derepression : operon turn on
เมื่อใช้ glucose จนหมด เซลล์จึงใช้ lactose แทน
lactose ทาหน้าที่เป็ น Inducer จับกับ repressor
Inducer-repressor complex จับ operatorไม่ได้
RNA Pol จับ promoter ได้ และ transcribe lacZ,
lacY และ lacA ให้ mRNA
ตามด้วย translation ของ mRNA ให้ enzymes ทั้ง 3
E.coli ใช้ lactose เป็ นแหล่งพลังงานได้
34
Derepression (turn on) เมื่อต้องการใช้ lactose
35
2 Positive Control ของ lac Operon
operon turn off ยกเว้นมี บางอย่างมา turn on
เลี้ยง E.coli ใน lactose เมื่อขาด glucose
ทาให้ระดับของ cAMP [cyclic 3’, 5’-adenosine
monophosphate] เพิม่ ขึ้น แต่การ control ของ cAMP
ต้องการ binding protein ที่เรี ยกว่า
Catabolite activator protein = CAP
CAP-cAMP complex จับ Lt Promotor
ทาให้ RAN polymerase
จับ Rt Promotorได้
36
Positive control ของ lac Operon
โดย cAMP
37
RNA polymerase สามารถtranscribe lacZ, lacY
และ lacA ให้ได้ mRNA ซึ่งจะตามด้วย
translation ให้ b-galactosidase, Permease และ
Transacetylase
ผล E. coli ใช้ lactose ใน media เป็ น source ของ
พลังงานได้
Positive control ของ Operon ด้วย CAP cAMP complex ไป turn on Operon พบใน operon
อื่นด้วยเช่น ara operon (arabonose) และ
38
gal operon (galactose)
Operon สาหรับ Catabolic enzyme
lac operon, ara operon, gal operon
-------------------------------------------------Operon สาหรับ Anabolic enzyme
trp operon
39
trp operon
(อ่านว่า trip operon)
40
trp operon
กลุ่ม genes code enzymes ผลิต Tryptophan
ประกอบด้วย 6 genes คือ
trpR, trpE, trpD, trpC, trpB, และ
trpA
และ 3 regulatory sequences คือ
trpP, trpO, Leader และ Attenuator
41
trpE, trpD, trpC, trpB, และ trpA code ให้
3 enzymes
Chorismic acid ---------------> Tryptophan
trpR code ให้ Aporepressor
ระดับ tryptophan เป็ นตัว turn on หรื อ turn off
operon
42
Control ของ trp operon 3 วิธี
1. Negative control เรี ยกว่า
Derepression
2. Positive control เรี ยกว่า Repression
3. Attenuation control
43
1. Negative control
มี high tryptophan (ไม่ตอ้ งการสร้าง tryptophan)
โดย trpR code Aporepressor
และ
tryptophan ทาหน้าที่เป็ น corepressor จับกับ
Aporepressor ได้เป็ น Aporepressor-tryptophan ทา
หน้าที่เป็ น Repressor
44
High tryptophan repression (negative control)
45
2. Positive control
เมื่อ low tryptophan (ต้องการสร้าง)
trpR ---> mRNA ---> Aporepressor monomer
(inactive) ----> RNA Pol จับ trpP --> transcribe --->
genes ใน operon ทั้งหมด ---> mRNA code enzymes
สร้าง tryptophan
46
Low tryptophan, no repression (positive control)
47
3. Attenuation control
3.1 Low tryptophan :
transcription of trp structural genes
3.2 High tryptophan :
attenuation, premature termination
48
3.1 Low tryptophan
RNA Pol อ่านผ่าน trpL, Attenuator และ
structureal genes ทั้งหมด ----> mRNA ---> enzymes ----> สร้าง tryptophan
เพราะ Terminator ของ Attenuator เป็ น single
strand จะ form เป็ น 1 hairpin
49
Attenuation control
when low tryptophan
50
3.2 High tryptophan
RNA Polymerase อ่านผ่าน trpL และ Attenuator
ได้ถึง terminator
ที่ terminator DNA strand ซึ่งเคยเป็ น single strand
จะจับกันเองเป็ น 2 hairpin ยับยั้งการอ่านของ RNA
Pol ทาให้ RNA Pol หลุดออก ---> ไม่มี transcription
----> no tryptophan synthsis
51
Attenuation control
when high tryptophan
52
Transcriptional Control in
Eukaryotes
53
Transcriptional Control in Eukaryotes
1.
2.
3.
4.
5.
RNA Polymerases
Promoters
Transcription Factors
Enhancers and Silencers
Upstream promoter elements
54
1. RNA Polymerase
Eukaryotic cell มี 3 types คือ
RNA Pol I -> rRNA precursor
(18 S + 28 S +
5.8 S)
RNA Pol II -> mRNA precursor
RNA Pol III -> tRAN precursor และ
5S rRNA precursor
55
2. Promoter
--> promoter สาหรับ RNA Polymerase
แต่ ละชนิด ต่างกัน และ
--> promoter มี element(s) ซึ่งเป็ น
recognition site(s) สาหรับ RNA
Polymerase เพื่อการ control ต่างกัน
56
3. Transcription Factors
ช่วยการทางานของ RNA Pol โดยจับ
DNA binding domain และ transcription
activation domain ช่วยให้ RNA
Polymerase --> Faithful transcription
57
4. Enhancers and Silencers
ไม่เป็ นส่ วนของ promoter แต่ช่วย
stimulate transcription จาก promoter
จัดเป็ น fixed spatial relationship ในการ
control genes
อาจพบอยูไ่ ด้หลาย position ใน DNA
58
a) Enhancer อยู่ upstream
b) Enhancer อยู่ downstream
c) Enhancer อยูใ่ น intron
silencers คล้าย enhancer
enhancers และ silencers
แตกต่างกันแล้วแต่ genes
59
5. Upstream promoter elements
เป็ น binding site สาหรับ transcription
factors ของบาง genes
ไม่เป็ นส่ วนของ promoter
Upstream elements
RNA Pol
60
Control ของ RNA Polymerase I
Promoter: มีส่วน control อยูท่ ี่ 2 blocks คือ
1) Core element (Core) : position
ระหวาง
- 45 ถึง +20
่
สาหรับ RNA Pol
2) Upstream control element (UCE) : position
ระหวาง
-156 ถึง ่
107 เพื่อ transcription มี
ประสิ ทธิภาพ
61
Promoter สาหรับ RNA Pol I
UCE
CORE
-156
-107
-45
+1 +20
Human rRNA promotor :
RNA Pol I จับ -45 (downstream) ถึง +20 (upstream)
TIF-I จับ -67 (downstream) ถึง -14 (upstream)
RNA Pol I + TIF-I จับ -67 ถึง +20
62
Control ของ RNA Polymerase II
Promoter: มี control element 2 แบบ แล้วแต่ genes
1. TATA box หรื อ Hogness box
consensus sequence TATAAAA ที่ -25
ตองการ
upstream promoter
้
element 21 bp
(3 repeats) ระหว่าง - 40 และ -103
2. CAAT box
consensus sequence (GC)CCAATCT ที่ -75
63
Promoter (5’flanking region) สาหรับ RNA polymerase
II
64
Transcription factor:
สาหรับ RNA polumerase II
TFIIA, B, D, E และ F ยังไม่รู้ activity ทั้งหมด
TFIID จับ TATA box
65
Enhancer: stimulate transcription จาก promoter
ไม่มี consensus sequences
เป็ น tissue-specific เช่น
mouse immunoglobulin enhancer แสดงออกใน
immunoglobulin genes ในเซลล์ immune
system แต่ไม่แสดงออกใน mouse connective
tissue cell
66
Enhancer สาหรับ RNA polymerase II
67
Silencer: prohibit transcription
เช่น mating system ของ yeast MAT, MAL
และ MAR
MAL และ MAR ไม่ active เพราะมี silencer
ทาให้ chromatin coil --> condensed,
inactive form
68
Control ของ RNA Polymerase III
Promoter: เป็ น Internal promoter
สาหรับ 5S RNA gene : promoter มี control
element ระหว่าง + 55 ถึง + 80
สาหรับ tRNA gene : promoter บน 2 ส่ วน
แยกกัน A block ระหว่าง + 8
ถึง
+ 30
B block ระหว่าง + 51 ถึง +
69
Transcription factor:
TFIIIA, TFIIIB และ TFIIIC
TFIIIA และ TFIIIC จับ internal promoter
TFIIIB จับ upstream ใกล้ start site
RNA Pol III จับ downstream ในตาแหน่ง
start site
70
Posttranscriptioal Control in Eukaryote
RNA transcript ใน nucleus ที่ยงั ไม่ modified
เรี ยกว่า Heterogeneous nuclear mRNA
(hn RNA) ซึ่งถูก modified ต่อไป
1. Capping
2. Tailing
3. Intron Splicing
71
RNA script ของ RNA ที่สงั เคราะห์ได้ใหม่
72
1. Capping:
modification of primary RNA script ที่ 5’ end
โดยเพิ่ม 7-methylguanosine เข้าที่ 5’ end เรี ยกว่า
Cap
เพื่อป้ องกันจาก nuclease, recognition ของ mRNA
โดย ribosome และ transport RNA เข้า - ออก nucleus
Capping ของ
newly transcribed
RNA
73
2. Tailing:
การเติ่ม Adenine จานวนมากเข้าที่ปลาย 3’ end
โดย poly-A polymerase เรี ยก process ว่า
Polyadenylation
เพื่อ stability และ transportation RNA ออก
จาก nucleus
Polyadenylation
ใน newly
transcribed RNA
74
3. Intron splicing:
mRNA ที่ transcribed ได้ใหม่ เรี ยกว่า
Heteronuclear RNA (hn RNA) เป็ น precusor mRNA
หรื อ immature RNA ที่คงมี Intervening sequences
(ลาดับขวางตอน) หรื อ Introns ซึ่งต้อง removed
ก่อน transport ออกไป cutoplasm เหลือแต่ segments
ที่ translate ได้ คือ Exons ซึ่งต้องถูกต่อเข้าหากันได้
เป็ น mature mRNA โดย Splicing process ด้วย
RNA เอง หรื อด้วย protein เฉพาะ
75
RNA processing ภายหลัง Transcription
76
Intron :
• Non-coding segment ของ DNA ที่ถูก transcribed
ออกมาใน hnRNA หรื อ rRNA precursor แล้ว
• ถูกตัดออกทิ้งที่ base pairs ข้าง exon
Exon :
• Coding segment ของ DNA หรื อ segment ส่ วน
ของ structural gene นัน่ เอง
• แต่ละ exon ต่อกันกลายเป็ น mature RNA
77
RNA บางอย่าง (snRNA) ทาหน้าที่เป็ น Enzymes
และ Molecular scissors มี enzymatic
activity โดยใช้ sequence ของตนเอง กระทา
บนตนเอง เรี ยกว่า Ribozyme
Ribozyme ทางานเหมือน endonuclease,
polymerase, transferase หรื อ ligase
RNA จึงทาหน้าที่ splice exons ได้
78
Intron แบ่ งได้ เป็ น 3 กลุ่มใหญ่
1. Group I intron : ใน 35 S rRNA
ที่ 5’ ของ intron มี UA และที่ 3’ มี G
2. Group II intron : ใน genes ของ yeast
mitochondria
ที่ 5’ มี G และ ที่ 3’ มี A-Nn-G
3. Nuclear mRNA intron
ที่ 5’ มี G และ ที่ 3’ มี TACTAAC box บน
DNA
(หรื อ UACUAAC บน RNA)
79
Mechanism ของ Splicing
1. Self splicing
Autocatalytic property of intron เอง
1.1 ต้องการ Guanine-containing
nucleotide (GMP, GDP, GTP)
1.1ไม่ตอ้ งการ Guanine-containing
nucleotide
2. Spliceosome
Protein-intron complex
80
1.1 ต้องการ GMP, GDP, GTP: Group I
intron
<--exon1--U- A---intron ----G - U---exon2-->
U-A bond ที่ 5’ ของ intron Aถูกถ่ายไป
จับกับ
GTP ได้ G = A
U ที่ เหลือปลายอิสระจะไปแทนที่ G ที่
81
3’
82
1.2
ไม่ตอ้ งการ nucleotide : Group II
intron
<---exon1-- G-U---intron---A---AG ---exon2->
G ที่ 5’ ของ intron ถูกถ่ายไปที่ A
ภายใน intron
ซึ่งใกล้ 3’
ได้รูปแส้ (lariat structure)
nuclecotide อิสระที่ปลาย 3’ exon จะไป
83
แทนที่
84
2. Spliceosome :
<--exon1-- GU---intron---A---AG --exon2-->
consensus sequence ของ intron ใน hn RNA คือ
5’ เป็ น GU, 3’ เป็ น AG, และ branch point เป็ น A
ที่ขวาสุ ดของ UACUAAC ซึ่งใน DNA คือ
TACTAAC หรื อเรี ยกว่า TACTAAC box
Spliceosome คือ RNA + Protein ประกอบด้วย 5
small nuclear RNA เรี ยก U1, U2, U3, U4, U5 &
U6
แต่ละ RNA โมเลกุล มี 1 หรื อ > 1 protein
รวมเรี ยกว่า Snurps หรื อ snRNPs
85
Operation ของ Spliceosome:
U1 & U2 bind ที่ 5’end point และ ที่ branch
point ของ intron
U5 & U4/U6 ร่ วม bind ได้ complete
spliceosome
และได้ lariat structune โดยปลายของ exons ต่อ
กันแล้ว snRNPs และ intron หลุดอิสระ
86
87
Alternative splicing
ในบางกรณี Splicing site ที่ 5’ และ 3’ บน intron
อาจเปลี่ยนได้ ทาให้ single gene เมื่อ
posttranscription แล้วอาจได้ mRNAหลายแบบ -->
ผลิต protein ได้หลายชนิด
เช่น Immunoglibulin genes code ให้ antibody หลาย
ชนิด
88
89
Reverse transcription
Synthesis DNA จาก RNA
โดย RNA-dependent DNA polymerase หรื อ
Reverse transcriptase (RT)
DNA ที่ได้เรี ยกว่า
complementary DNA (cDNA)
เช่น RNA tumor virus เมื่อเข้าไปในเซลล์จะสร้าง
cDNA ก่อน integrate เข้า DNA ของ host และ
cDNA ที่สร้างจาก mRNA in vitro (ใน
หลอดแก้ว)
90
Reverse
Transcription
91
Central Dogma
Version
1
Version 2
Version 3
92
The Most Update Central Dogma
DNA
Self replication
Transcription
Reverse transcription
RNA
Self replication
Translation
Translation w/o transcription
(forbidden)
Protein
93
94