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CONTAMINANTS ALIMENTAIRES
ET CIBLES CELLULAIRES
Exemple des pesticides
Laurence Gamet-Payrastre
[email protected]
• Des facteurs de risque pour la santé
chez l’homme
• Mécanisme d’action de la toxicité des
pesticides :Les cibles cellulaires
• Les approches en toxicologie cellulaire
et moléculaire
Les pesticides : généralités
● Définition
toute substance naturelle ou de synthèse capable de contrôler, repousser
ou détruire des organismes vivants ou de s’opposer à leur développement.
Produits phytosanitaires destinés à un usage agricole ou non agricole
● Classification selon leur activité biologique
- les insecticides
- les fongicides
-les herbicides
- les divers (nématicides, rodenticides, taupicides, etc…)
● Classification par famille chimique:
- Composés organiques chlorés (DDT, Lindane, Aldrine, Dieldrine, etc.)
- Composés organiques phosphorés (Parathion, Fenthion)
- Composés organométalliques (Dérivés de l’urée, carbamates, etc.)
- pyréthrinoides de synthèse, triazine etc…. "
Les pesticides : généralités
• Usage agricole (90%)
- 3 ième consommateur mondial de pesticides
- 4 ième utilisateur européen (par hectare de surface cultivée )
• Usage non agricole (10%)
- traitement des parasites dans la maison
- traitement des bois et textiles
- soins des animaux
- traitement des plantes d’intérieurs, jardins, espaces verts
Les pesticides : généralités
Exposition professionnelle
• Population définie
1.3 millions de personnes professionnellement
exposées en France (X2 avec les retraités)
• Molécules définies
• Temps d’exposition défini
Exposition non professionnelle
80% via l’alimentation
Exposition alimentaire
-Mélange de résidus
-long terme
-Faibles doses
Les pesticides : des facteurs de risques
Études épidémiologiques dans les
populations professionnellement exposées
L’exposition professionnelle aux pesticides, et en particulier chez les
agriculteurs, est souvent corrélée à un risque accru de troubles de la santé
- Certains cancers (hématopoïétique, cerveau, prostate)
- Certaines maladies neuro-dégénératives comme la maladie de Parkinson
- Certaines déficiences au niveau du développement cérébral
- Des troubles de l’immunité
- Des troubles de la reproduction
- Des perturbations endocriniennes
Les pesticides : des facteurs de risques
Exposition professionnelle des parents
pendant la période prénatale
associées à diverses pathologies chez les enfants
• Les cancers hématopoïétiques tumeurs du cerveau,
• des troubles au niveau du système nerveux central
(développement cérébral, neuro-comportement) ou
de l’immunité
Les pesticides : des facteurs de risques
Certains pesticides, sont capables d’induire in vitro dans des cellules
humaines des perturbations du fonctionnement cellulaire
Cibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué
Statut oxydo-réducteur
Transduction du signal
la génotoxicité
les systèmes
de détoxification
La régulation de la prolifération
de la survie
Mort cellulaire programmée
Cibles cellulaires des pesticides
la génotoxicité
Elimination du conjugué
• Dans les lymphocytes d’agriculteurs on observe une augmentation
des cassures simples et doubles brins de l’ADN (MN) (Tope A. et al,
2006)
pesticides
• Augmentation des adduits à l’ADN dans le sang périphériques des
agriculteurs (J. Le Goff, ,2005)
les systèmes
de détoxification
Dans dommages
les cellules
RTG2,
l’alachlore
des
cassures
•Les •différents
à l’ADN
sont:
les basesinduit
oxydées
(8oxodG),
JM, 2010)
• les coupures
simples et doubles brins,
• les adduits à l’ADN
d’ADN (Parra
REPARATION ADN
Ralentissement du cycle cellulaire
Système d’excision et réparation des
dommages
Système enzymatique de réparations des
cassures
30 000 lésions spontanées / jour/ cellule
Cibles cellulaires des pesticides
Ils peuvent affecter la structure du DNA et
donc la transcription de gènes importants
Elimination du conjugué
ils peuvent conduire à des mutations qui RNA, Protéines
affecteront
la survie
la capacité de
Réparation
de lou
’ADN
prolifération des cellules.
xénobiotiques
les systèmes
de détoxification
mutation
Accumulation
d’anomalies génétiques
définitives dans des
gènes contrôlant la survie
et la prolifération
Initiation
Cellule transformée
Conséquence
de la génotoxicité des pesticides ?
Stimulation de
la prolifération
de la cellule transformée
Promotion
tumeur
Cibles cellulaires des pesticides
conséquence de la génotoxicité : apoptose
Réparation de l ’ADN
Elimination du conjugué
ARN
Protéines
xénobiotiques
les systèmes
de détoxification
mutation
initiation
Mort cellulaire programmée
Ex Methoxychlor induit une atrophie du thymus
via transformées
Cellules
l’induction de l’apoptose dans les thymocytes.
Fukuyama T, 2010
promotion
tumeur
Cibles cellulaires des pesticides
conséquence de la génotoxicité : apoptose
mort cellulaire programmée apoptose
Processus physiologique de régulation du nombre de cellules
■ Au cours du développement embryonnaire,
■ Dans la défense immunitaire
■ Pour le renouvellement des cellules du tractus digestif
Le phénomène d'apoptose
« mort cellulaire programmée »
modifications structurales
•
Plusieurs étapes en cascade,
dont les effets sont
visualisables dans les
cellules :
– flip-flop de la
phosphatidyl-sérine du
feuillet cytosolique au
feuillet extracellulaire de
la membrane plasmique
– Boursouflure
membranaire
– fragmentation de l'ADN
nucléaire
– fragmentation du
cytoplasme , formation
des corps apoptotiques
Cibles cellulaires des pesticides
conséquence de la génotoxicité : apoptose
• Le paraoxon modifie le potentiel mitochondrial transmembranaire des cellules leucémiques
Apoptose
Modifications
biochimiques
EL4 T, induit la
libération du cytochrome
c dans le cytosol et l’activation conséquentes des
caspases (Saleh AM et al, 2003).
• le paraquat dichloride, un herbicide,induit l’apoptose via l’induction de P53
P53
(Takeyama N, et al, 2004)
Modification de la
Independent
P53
répartition des
pathways
Dependent via l’activation des caspases dans
• Le diazinon active l’apoptose
les cellules de
phospholipides
pathways
teratocarcinome humain (Aluigi MG, 2010)
membranaires
Hydrolase
Cytosolique
inactives
Ca++
Hydrolase
Cytosolique
actives
Lésions irréversibles
des protéines cytosoliques
APAF-1 : apoptosis protease activating factor-1 ;
CAD : caspase-activated internucleosomal DNAse ;
IAP : inhibitors of apoptosis proteases ; PARP : poly(ADPribose) polymerase ; pro-CASP-9 : précurseur inactif de la
caspase initiatrice CASP-9.
Cascade d'activation
d'enzymes
Hydrolyze des enzymes
de réparation de l'ADN (PARP)
Et des enzymes de structure :
gelsoline lamine
Fragmentation de l'ADN
Cibles cellulaires des pesticides
la toxicité d’un xénobiotique peut
être due à une variation du statut
oxydo-réducteur de la cellule
Cibles cellulaires des pesticides
Statut oxydo-réducteur : définition
Attaque lipide, DNA, protéines
Facteurs environnementaux
Radiation, ozone, hyperoxie, xénobiotiques
Stress oxydant
O2
Dégâts cellulaires
Mutation DNA
Echec régulation
statut redox
Radicaux primairesROS
dérivent
de oxygénées
l’oxygène réactives
(OH., O2., NO.)
espèces
jouent
un rôle cellulaire dans :
cytoP450
Initiation
défense, cycle cellulaire, différenciation, mort cellulaire, transduction des signaux
apoptose
Inflammation
Défenses
cellulaires
Systèmes enzymatiques
(SOD, catalase, glutathion peroxydase)
glutathion
Anti-oxydants vit E, C
PROTECTION
Réparation
DNA
Promotion:
expansion clonale
Croissance et
Instabilité génétique
tumeur
Cibles cellulaires des pesticides
Exemple d’effet pro-oxydant des pesticides
•
Dans les follicules ovariens isolés, le methoxychlore entraine une diminution
des activités enzymatiques régulant le statut oxydo-réducteur (SOD, catalase,
super-oxyde dismutase) et modifie l’activité respiratoire des mitochondries.
Gupta RK et al, 2006
•
Le malathion (OP) inhibe l’activité des enzymes de régulation du stress
oxydant , diminue la production d’ATP et altère la matrice mitochondriale.
Delgado
EHB et al, 2006.
•
Le traitement des rats avec du chlorpyrifos (insecticide, OP) conduit à une
diminution des activité des enzymes du type SOD, catalase, à une déplétion en
glutathion intracellulaire dans le foie , le rein et le cerveau des animaux traités
avec 100mg/kg; (forte dose). Verma RS et al, 2007.
•
Enantioselective cytotoxicity of isocarbophos is mediated by oxidative stress-induced JNK activation in
human hepatocytes. Liu H, Liu J, Xu L, Zhou S, Li L, Liu W. Toxicology. 2010 .
•
Hydrogen peroxide induced by the fungicide prothioconazole triggers deoxynivalenol (DON) production
by Fusarium graminearum. Audenaert K, Callewaert E, Höfte M, De Saeger S, Haesaert G. BMC Microbiol.
2010
•
Pentachlorophenol and its derivatives induce oxidative damage and morphological changes in human
lymphocytes (in vitro). Michałowicz J.Arch Toxicol. 2010
•
Oxidative stress induced by loss of Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD1) or superoxide-generating
herbicides causes axonal degeneration in mouse DRG cultures.Fischer LR, Glass JD. Acta Neuropathol.
2010
Cibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué
Statut oxydo-réducteur
Transduction du signal
la génotoxicité
les systèmes
de détoxification
La régulation de la survie
de la prolifération
Mort cellulaire programmée
La transduction du signal
Cibles cellulaires des pesticides
La transduction du signal
Tout processus qui convertit un type de signal ou un stimulus vers une réponse cellulaire
• via une succession d’évènements biochimiques (de phosphorylation et de
déphosphorylation)
• dans lesquels interviennent de nombreuses enzymes (kinase/phosphatase) i.e. les
intermédiaires de la signalisation
La transduction du signal peut se faire soit via
- La liaison de molécules sur des récepteurs
membranaires ou intracellulaires
Cascade de phosphorylation
déphosphorylation
- Un stimulus « physique »
(lumière/cellules de la rétine)
- L ’interaction directe d’une molécule
(xénobiotiques) avec les intermédiaires de la
signalisation
Réponse cellulaire,
survie, prolifération,
mort cellulaire,
différenciation
Cibles cellulaires des pesticides
• Les pesticides organochlorés (endosulfan, lindane) active la voie des MAP kinases
(raf MEK et ERK) ainsi que la transcription de c-Jun. Ledirac N et al, 2005.
• L’isocarbophos, un organophosphoré, induit la production de ROS, l’activation de la voie
dépendante de la JNK et l’apoptose dans les cellules HepG2. Liu H, 2010
La phosphorylation et la déphosphorylation modulent l'activité de certains facteurs
de transcription :
•en les activant directement (exemple : facteur AP-1)
•en modifiant leur localisation cellulaire (exemple : facteurs NFkB et NFAT)
Les intermédiaires
Approches en toxicologie cellulaire
et moléculaire
Elimination du conjugué
Statut oxydo-réducteur
Transduction du signal
la génotoxicité
les systèmes
de détoxification
La régulation de la prolifération
de la survie
Mort cellulaire programmée
Toxicologie cellulaire et moléculaire
Les approches
Approches en toxicologie cellulaire
et moléculaire
Estimation de la viabilité
• MTT
sels de tetrazolium converti par les deshydrogenases
mitochondriales actives en formazan (absorbance 570nm)
• Comptage cellulaire
comptage des cellules flottant dans le
milieu de culture et comptage des cellules adhérentes
Approches en toxicologie cellulaire et
moléculaire
Génotoxicité
Comet assay
mesure des cassures simples et doubles brins induites
- directement par un agent génotoxique,
- indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages
- lors de processus secondaires de fragmentation de l’ADN tel que l’apoptose.
- Principe : électrophorèse en gel d’agarose de noyaux marqués avec un agent
fluorescent.
les noyaux dont l’ADN a subi des cassures prennent une forme de comète et
les noyaux dont l’ADN n’est pas endommagé restent ronds
Approches en toxicologie cellulaire et
moléculaire
Stress oxydant
• Taux de ROS nombreuses sondes fluorescentes réactives avec les
radicaux libres
• Mesure de l’activité des enzymes régulant le stress oxydant
- SuperOxyde Dismutase (SOD): 2 O2° + 2 H→2 H2O2 + O2
- Catalase: 2H2O2→ 2 H2O + O2
- Glutathion peroxydase: H2O2 + 2 GSH→ 2 H2O + GS-SG
• Dosage des taux de glutathion
• Dosage des marqueurs périphérique d’oxydation (8oxodg dans le plasma;
détection des bases ou nucléotides modifiés par chromatographie liquide
haute perf. (HPLC) + Spectrométrie de masse (MS)
• Mise en évidence marqueurs cellulaires de peroxidation lipidique (HNE (4hydroxy -2-nonenal; MDA malonyldialdehyde) utilisation d’anticorps
Approches en toxicologie cellulaire et
moléculaire
Signalisation cellulaire
• Western blot : migration de protéines dans un gel dénaturant en
fonction de leur poids moléculaires : identifier une protéine spécifique
dans un extrait cellulaire
Approches en toxicologie cellulaire et
moléculaire : signalisation cellulaire
• Arrays (Protein) antibody-array : visualiser et quantifier
l’expression de plusieurs protéines d’un même extrait
cellulaire
Plateforme Biopuces
Génopôle Toulouse Midi Pyrénées
Approches en toxicologie cellulaire et
moléculaire : apoptose
Cytométrie en flux
Incorporation de iodure de propidium
dans les noyaux et analyse de la quantité de
fluorescence qui est le reflet de la quantité d’ADN
Sub G0/G1Cellules apoptotiques
G1
G2/M
Double marquage iodure de propidium/ l’anexine-fluorescéine
Dans les cellules apoptotiques les phosphatidyl serine membranaires sont à l’extérieur
et peuvent fixer l’anexine. Les membranes ne sont pas perforées et l’iodure de
propidium ne pénètre pas .
Approches en toxicologie cellulaire et
moléculaire : apoptose
DNA Ladder
migration de l’ADN sur gel
d’agarose.
Il apparaitra sous forme de petit
fragments (échelle) le long du
gel dans le
cas de cellules apoptotiques
sinon on ne
voit qu’une seule bande.
Approches en toxicologie cellulaire et
moléculaire : apoptose
Mesure de l’activité des
caspases effectrices (3)
conclusion
• Les pesticides affectent différentes cibles
qui contrôlent la croissance et la survie
des cellules humaines.
• Ces effets sont observés pour
molécules testées individuellement
des
• Qu’en est-il de l’effet des mélanges et des
faibles doses