ADN et chromosomes Le nucléosome 1

Plan

I - Structure et fonction de l'ADN

II - ADN chromosomique et emballage dans la fibre chromatinienne – organisation des gènes le long de la molécule d'ADN

III - Structure globale des chromosomes

–emballage de la molécule d'ADN dans

les chromosomes

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II - ADN chromosomique et emballage dans la fibre chromatinienne 1 - Le chromosome 2 - Organisation des gènes sur le chromosome 3 - Cycle du chromosome 4 - Séquences nécessaires et suffisantes pour se dupliquer et passer d'une génération à l'autre 5 - Emballage de l'ADN 6 - Régulation de l’activité de la chromatine 3

1 - Le chromosome • L'ADN est divisé en chromosomes • Génome = 3,2 milliards de paires de nucléotides • 24 chromosomes différents • 1 chromosome = 1 molécule d'ADN + protéines • ADN + protéines = chromatine 4

Chromatine (Walter Flemming 1882) • ADN + protéines • Décrit par Flemming (1882) • Colorable 5

Walter Flemming (1843-1905) • Cytologiste allemand connu pour avoir décrit le premier la division cellulaire appelée mitose .

• Également le premier à décrire les chromosomes .

• Études de médecine et de zoologie jusqu’en 1868 dans plusieurs universités allemandes.

• Thèse sur les muscles ciliaires • Assistant, puis professeur • S'installe définitivement à Kiel comme professeur d'anatomie et directeur de l'institut d'anatomie, jusqu'à sa retraite en 1901.

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Walter Flemming (1843-1905) • Vers le milieu du XIXe siècle, la connaissance de la division cellulaire était limitée par la faible qualité des lentilles des microscopes et des méthodes de coloration .

• Certains scientifiques pensaient qu'il s'agissait d'une division directe, mais d'autres postulaient l'existence de phases intermédiaires pendant lesquelles le noyau « père » se dissociait avant de reconstituer deux noyaux fils.

• Walter Flemming est le premier à décrire, dans son ouvrage Zellsubstanz, Kern, Zelltheilung, publié en 1882, les différentes phases de la division cellulaire .

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Walter Flemming :

Les différentes phases de la division cellulaire • A cette occasion, il forge les mots mitose , chromatine , plan équatorial et achromatine .

• Il est également un des premiers cytologistes à décrire les chromosomes pendant la division cellulaire, sans pour autant expliquer leur rôle • Il remarque la constance de leur nombre pour une espèce donnée.

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Walter Flemming :

autres travaux • Amélioration de certains fixateurs colorants cellulaires et • Description de l'amitose , division cellulaire directe par étranglement du corps cellulaire et du noyau, phénomène qu'il considère toutefois, de façon erronée, comme pathologique.

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Protéines de la chromatine • Emballage de l'ADN • Régulation de l'expression des gènes • Réplication et réparation de l'ADN 10

Chromosome bactérien • Une seule molécule d'ADN circulaire • Protéines d'emballage différentes • Mal connu 11

Les chromosomes eucaryotes • Chaque cellule a deux copies de chaque chromosome – une héritée du père et – une héritée de la mère • Chromosomes homologues • Exception : chromosomes sexuels chez le mâle – Y hérité du père – X hérité de la mère 12

Jeux chromosomiques • Homme : 22 paires d'autosomes + X + Y • Femme : 22 paires d'autosomes + X + X • Homme : 46,XY • Femmes : 46,XX 13

Mise en évidence des chromosomes • Hybridation • Colorants 14

• Hybridation de chromosomes humains masculins • Caryotype spectral (peinture chromosomique) Fig 4-10 15

Fig 4-11 • Chromosomes humains masculins • Coloration au Giemsa – chaque chromosome a un marquage longitudinal spécifique qui permet de le reconnaître 16

Caryotype • Affichage des 46 chromosomes à la mitose • Mise en évidence des anomalies 17

Caryotype féminin normal 18

• Anomalie chromosomique – (A) Coloration au Giemsa – (B) Peinture chromosomique 4 12 4 12 N t Fig 4-12 N t 19

2 - Organisation des gènes sur le chromosome • Un gène  – protéine – ARN 20

Complexité d'un organisme  nombre de gènes • Corrélation positive • Bactérie : 500 • Humain : 30 000 • Beaucoup d'ADN – sans information – dépotoir (!) – expression des gènes 21

• Génomes ayant été totalement séquencés – (A) Eubactéries Table I-1 22

• Génomes ayant été totalement séquencés – (B) Archae Table I-1 23

• Génomes ayant été totalement séquencés – (C) Eucaryotes Table I-1 24

• Génome de Saccharomyces cerevisae • 16 chromosomes • Couleurs fonctions du pays qui a séquencé • 12 147 813 nucléotides • 6000 gènes Fig 4-13 25

Complexité d'un organisme  génome (  ADN) • Corrélation non systématique • Génome humain = 200 X génome de

Saccharomyces cerevisae

• Certaines plantes ou amphibiens = 30 X génome humain • Amibe = 200 X humain • Certains organismes proches les uns des autres = 100 X en raison de l'ADN en excès (même nombre de gènes) 26

Variation du nombre de chromosomes • Homme : 46 • Certains cervidés : 6 • Certaines carpes : >100 • Espèces très proches de Muntjac • Pas de relations simple entre – nombre de chromosomes – complexité de l'espèce – taille du génome 27

• Fusion de Fig 4-14 28

Analyse du séquençage du génome • 1999 Séquençage du chromosome 22 (le plus petit) 29

1,5% du génome Fig 4-15 30

Analyse du séquençage du génome • Science et Nature février 2001 • Human Genome Project (2001) 31

• Données statistiques du chromosome 22 et de tout le génome humain Table 4-1 32

Génome humain • 25 fois plus gros que tous les génomes séquencés précédemment • 8 fois la somme de tous les génomes séquencés précédemment • Séquençage à 1000 nucléotides par seconde • A fait reconsidérer toute la biologie • 4 ème édition du livre entièrement revue 33

Fig 4-16 • Échelle du génome – (A) si 1 mm entre deux bases… – (B) génome = 3 200 km – un gène codant pour une protéine tous les 300 mètres – un gène  30 mètres 34

Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans le chromosome 1 Quelques % codent pour des protéines ou de l'ARN de structure ou catalytique Le reste = petits morceaux d'ADN mobiles qui se sont incorporés dans le chromosome au cours de l'évolution 35

Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans le chromosome 2 - Taille moyenne d'un gène élevée – une protéine moyenne = 430 acides aminés  1 300 paires de nucléotides – or un gène moyen = 27 000 paires de nucléotides – beaucoup d'ADN non codant qui s'intercale dans l'ADN codant : introns / exons – Alternance exons / introns dans les gènes – Pas d'introns dans les organismes à génome compact  moins d'ADN – Séquences régulatrices d'ADN des dizaines de milliers de paires de nucléotides 36

• Séquence nucléotidique du génome humain – LINES, SINES, retro-viral like elements, DNA only transposons : éléments génétiques mobiles qui se sont multipliés et insérés en différents endroits du génome Fig 4-17 37

• Séquence nucléotidique du génome humain – Segmental duplications : gros blocks (1 000 à 200 000 nucléotides) présents à 2 ou plus endroits du génome – Simple sequence repeats (< 14 nucléotides) répétés encore et encore Fig 4-17 38

• Séquence nucléotidique du génome humain – Plus de la moitié des séquences uniques sont des gènes – Le reste probablement des séquences régulatrices Fig 4-17 39

Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans le chromosome 3 - Grand désordre dans l'information – grande pagaille, fouillis, désordre – beaucoup d'ADN dépotoir – information importante répartie dans tout ce désordre – on n'a jamais rien éliminé 40

Problèmes posés par l'étude des gènes • La plupart de l'ADN est probablement sans importance • Un exon (petit)  145 nucléotides en moyenne • Exon flotte dans une mer d'ADN inutile • Nombreux réarrangements 41

Solutions pour l'étude des gènes • Basées sur l'observation : les séquences qui ont une fonction sont conservées pendant l'évolution • Comparaison homme / souris : l'homme et la souris ont divergé d'un ancêtre commun il y a 100 millions d'années • Les régions semblables sont celles dans lesquelles les mutations ont éliminé l'animal porteur par sélection naturelle : ce sont les régions conservées (  non conservées) • Les expériences de la nature permettent de mettre en lumière les régions les plus intéressantes du génome 42

Conservation de la synténie (ordre de gènes) entre l'homme et la souris HOMME Fig 4-18(AB) SOURIS 43

Histoire de notre chromosome 3 par comparaison avec celui d'autres mammifères Fig 4-19 Un changement tous les 5 à 10 millions d'années 44

Muller,S2000p206P NAS (fig1) 45

Muller,S2000p206PNA S (fig2) 46

Muller,S2000p206PNAS (fig3) 47

Muller,S2000p206PNAS (fig4) 48

Muller,S2000p206 PNAS (fig5) 49

3 - Cycle du chromosome • Cycle cellulaire • Interphase : réplication  chromosome interphasique • Mitose : condensation et séparation  chromosomes mitotiques : bien visibles 50

Cycle cellulaire Interphase synthèse protéique réplication de l'ADN et duplication des chromosomes Phase M Mitose Division cellulaire Fig 4-20 51

Fig 4-21 Chromosome interphasique Chromosome métaphasique 52

4 - Séquences nécessaires et suffisantes pour se dupliquer et passer d'une génération à l'autre • Origines de réplication – séquence d'ADN spécialisée – kinétochore – jusqu'à 100 000 paires de nucléotides chez l'homme • Télomères 2 par chromosome • Centromère 53

• les trois séquences d'ADN nécessaires pour le maintien d'un chromosome Fig 4-22 54

5 - Emballage de l'ADN • L'ADN est compacté en chromosomes • eg : chromosome 22 = 48 millions paires de nucléotides – ADN étiré = 1,5 cm – interphase  plus court – métaphase = 2  m –  compaction = 10 000 • Protéines de compaction • En interphase compaction = 1 000 55

Aspect dynamique du chromosome • En fonction du cycle cellulaire • En fonction de l'activité du chromosome – accès aux séquences spécifiques – expression des gènes – réplication de l'ADN 56

a) La fibre nucléosomale • Chromatine – ADN (50 %) – Protéines (50 %) • histones (60 millions de molécules de chaque classe par cellule) • protéines chromosomiques non histones • Nucléosome 57

Nucléosomes en microscopie électronique Fibre de 30 nm Cordon = ADN, perle = cœur nucléosomal 58

b) Noyau nucléosomal • De l'ADN (146 pn)... • enroulé autour d'un noyau protéique formé de 8 histones 2 X (H2A, H2B, H3, H4) • Premier niveau d'emballage de l'ADN (compacte l'ADN de 1/3) 59

Fawcett 60

Fawcett 61

Cook 62

Cook20 0?p?

• Digestion de la chromatine par les nucléases qui coupent l'ADN entre les nucléosomes – cf. Cook 63

Cook,P20 01p?

• Digestion faible : l'ADN exposé entre les noyaux nucléosomaux (= ADN de liaison) (linker DNA) est dégradé 64

Fig 4-24haut Noyau nucléosomal = 146 paires de nucléotides+ octamère d'histones 65

• Cœur protéique = octamère d'histones Fig 4-24bas 66

ADN de liaison (linker DNA) • Variable, de quelques paires de nucléotides à 80 paires de nucléotides environ • en théorie, 1 nucléosome = 1 noyau nucléosomal + 1 ADN de liaison adjacent • en pratique, 1 nucléosome = 1 noyau nucléosomal • En gros, il y a un nucléosome tous les 200 paires de nucléotides 67

Dans une cellule • 6,4 milliards paires de nucléotides  200  30 millions de nucléosomes 68

Structure du noyau nucléosomal • Résolu en 1997 • 1,65 tours d'ADN autour de l'octamère d'histones 69

Noyau nucléosomal (diffraction des rayons X) Fig 4-25 70

c) Histones • 1 histone  102 ~ 135 acides aminés • Structure commune : 3 hélices  par 2 boucles reliées 71

• Organisation structurale des histones du cœur protéique Motif des 4 histones Dimère H2A-H2B en "poignée de main" Fig 4-26 72

Formation du noyau protéique • Formation d'un dimère H3 - H4 • Formation d'un dimère H2A - H2B • (Dimère H3 - H4) + (Dimère H3 - H4) = (Tétramère H3 - H4) • Tétramère H3 - H4 + 2 (Dimère H2A H2B) = noyau protéique 73

• Assemblage d'un octamère d'histone Fig 4-27haut 74

• Assemblage d'un octamère d'histone • Les 8 extrémités -N font saillie Dimère H3 - H4 Dimère H2A - H2B Fig 4-27bas 75

Interface ADN / histones • 142 liaisons H entre ADN et histones • Histones riches en lys et arg (+) ADN chargé (-) • Longue queue N terminal  modifications covalentes 76

Conservation des histones • Parmi les plus conservées des protéines des eucaryotes • H4 petit pois et H4 de la vache ne diffèrent que à 2 positions sur 104 • Il existe des variants 77

d) Position des nucléosomes sur l'ADN • Flexibilité de l'ADN • Liaison d'autres protéines 78

Flexibilité de l'ADN • Tout ADN peut s'enrouler autour d'un nucléosome (en principe) • Il faut pouvoir courber l'ADN pour faire les 2 tours  compression du sillon mineur • AT est plus facile à courber que GC 79

Compression du petit sillon autour du nucléosome Fig 4-28 80

Flexibilité de l'ADN • Tout ADN peut s'enrouler autour d'un

nucléosome (en principe)

• Il faut pouvoir courber l'ADN pour faire

les 2 tours



compression du sillon mineur

• AT est plus facile à courber que GC • Certains nucléosomes ont une position très précise • En général position approximative 81

Liaison d'autres protéines • Favorise la liaison du nucléosome • Obstacle à la liaison du nucléosome • En fait tout est très dynamique 82

e) Fibre chromatinienne d'ordre supérieur • "Collier de perles" = rare dans la cellule vivante • Fibre de 30 nm beaucoup plus probable 83

Nombreux schémas de fibres de 30 nm • Zigzag… • et ses variations : "mosaïque fluide de variations sur le modèle zigzag" • Éléments qui interviennent – l'ADN de liaison – protéines de liaison à l'ADN – séquence de l'ADN 84

Bednar,J1998(fig1) 85

Bednar,J1998(fig2) 86

Bednar,J1998(fig3) 87

• Variations sur le modèle de la fibre de 30 nm en zigzag Fig 4-29 Interconversion des modèles les uns dans les autres 88

• Irrégularités de la fibre de 30 nm – régions avec des protéines de liaison à l'ADN – ADN sans nucléosomes Fig 4-30 89

Formation de la fibre de 30 nm • Histone H1 • Queues des histones 90

Histone H1 • Mal conservée • Liaison avec l'ADN et les protéines • Grande importance du point de sortie de l'ADN hors du nucléosome 91

• Rôle de H1 sur le nucléosome Fig 4-31 92

Queues des histones • Liaisons des nucléosomes les uns aux autres 93

Fig 4-32 • Rôle hypothétique des queues d'histones dans la formation de la fibre de 30 nm – les queues aident à la formation de la fibre de 30 nm – contact entre les queues et le nucléosome adjacent en diffraction de rayons X – liaison entre queue et ADN 94

6 - Régulation de l’activité de la chromatine • a) Les complexes de remodelage de la chromatine • b) Modifications des queues des histones 95

a) Remodelage de la chromatine : complexes de remodelage chromatinien • Machines protéiques qui hydrolysent de l'ATP • pour changer temporairement la structure des nucléosomes • et l'ADN est lié moins fort au noyau protéique du nucléosome • Mouvements de H2A H2B dans le noyau protéique 96

Conséquences du remodelage des nucléosomes • Accès de protéines aux nucléosomes – expression des gènes, réplication, réparation de l'ADN – Le nucléosome peut rester dans un état remodelé même après la dissociation du complexes de remodelage chromatinien mais liaisons ADN-protéines relâchées • Possibilité de changement de la position des nucléosomes le long de l'ADN 97

Modèle de mécanisme de certains complexes de remodelage chromatinie n Fig 4-33 Les contacts ADN histones sont faibles 98

SWI-SNF-B chromatin remodeling complex • A member of the SWI/SNF family of ATP-dependent chromatin-remodeling complexes ; • A multi-subunit complex that contains BRG1, BAF170, BAF155, BAF60a, BAF57, BAF53, actin, hSNF5/INI1, and BAF18 99

BAF BAP ChIP HDAC HMG MNase RSC SAGA SWI/SNF TBP Abréviations Brg1/Brm-associated factor; Brm-associated protein; chromatin immunoprecipitation; histone deacetylase; high mobility group; micrococcal nuclease; remodels the structure of chromatin; Spt –Ada–Gcn5–acetyltransferase; mating type switching/sucrose non-fermenting; TATA-binding protein 100

Nature Reviews Cancer 4, 133-142 (2004) THE SWI/SNF COMPLEX — CHROMATIN AND CANCER Charles W. M. Robert s & Stuart H. Orkin • Chromatin consists of DNA wrapped around nucleosomes in progressively higher-order structures. Histone acetyltransferases (HATs) are an example of complexes that covalently modify DNA and lead to relaxation of chromatin structure. SWI/SNF uses ATP hydrolysis to slide nucleosomes along the DNA helix and expose the DNA to transcription factors. Often, these two types of complex work in concert to regulate transcription.

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Kingston,RE1999 p2339(fig1) 102

• Composition de différents complexes de remodelage chromatinien ATP-dépendent Famille de complexes SWI/SNF en pourpre Homologues ISWI en rouge Kingston,RE1999p2339 (fig2) 103

Kingston,RE1999p2339 (fig3) 104

Kingston,RE1999 p2339 (fig4) 105

Complexes de remodelage chromatinien • Gros complexes protéiques de plus de 10 sous-unités • Permettent l'accessibilité à l'ADN quand nécessaire • Reformation des nucléosomes • Contrôle étroit par la cellule • Inactivés par phosphorylation pendant la mitose  compaction 106

Fig 4-34 Mécanisme cyclique de perturbation et reformation des nucléosomes 107

Travers,A1999p311(fig1) 108

Travers,A1999p311(fig2) 109

Travers,A1999p311(fig3) 110

b) Modifications des queues d'histones • Acétylation des lysines • Méthylation des lysines • Phosphorylation des sérines • Ubiquitinylation 111

Fig 4-35(A) • Modifications connues des 4 queues d'histones 112

Modifications des queues d'histones • Avant ou après leur synthèse • En général après l'assemblage en nucléosome • Enzymes nucléaires – HAT (Histone Acétyl Transférase) – HDAC (Histone DéACétylase) 113

Modifications des queues d'histones • Agit peu sur le nucléosome • Agit sur la stabilité se la fibre de 30 nm : eg acétylation déstabilise la chromatine • Attraction de protéines spécifiques • Modifications  code d'étirement de la chromatine à la cellule 114

Fig 4-35(B) Code de modifications des histones 115

Code de modifications des histones • Nombreuses combinaisons de modifications • Exemple : – vient d'être répliqué – ne pas transcrire 116

Conclusion : dynamisme de la chromatine • Complexes de remodelage chromatinien • Modifications des queues d'histones • Compaction / décompaction permanente • Coopération des deux mécanismes 117