Transcript BIOLOGIA MOLECULAR EN MEDICINA

BIOLOGIA MOLECULAR EN
MEDICINA
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
MARCACION DE SONDAS
PCR Y APLICACIONES:
CONDICIONES DE LA REACCION
PRIMERS DEGENERADOS
RT – PCR
REAL TIME PCR
Dra. Liliana N. Guerra
Marcación de SONDAS

LA PREPARACION DE LA SONDA ES CRITICA PARA
LAS TECNICAS DE HIBRIDIZACION MOLECULAR
EN LA HIBRIDIZACION:
LA SONDA Y EL ACIDO NUCLEICO A HIBRIDIZAR
DEBEN ESTAR COMO SIMPLE CADENA

SOUTHERN: SE TRATA EL GEL CON HCl PARA
DESNATURALIZAR EL ADN, SE NEUTRALIZA CON
NaOH Y SE TRANSFIERE A LA MEMBRANA EN
SOLUCION DE ALTA FUERZA IONICA

NORTHERN: NO ES NECESARIO EL
TRATAMIENTO, SOLO MANTENER ARN SIN
ESTRUCTURA SECUNDARIA
Marcación de SONDAS
TECNICAS MAS USADAS:

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NICK – TRANSLATION
RANDOM PRIMER EXTENSION
OLIGONOCLEOTIDES PROBES
SE USA UN NUCLEOTIDO MARCADO:


α–32P–d NTP, α-35S–d NTP, α–125 I–d NTP:
GENERALMENTE d CTP
biotina-11-d UTP, dioxigenina-11-d UTP
Marcación de SONDAS
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LA SONDA PUEDE SER/ O NO RADIOACTIVA,
EN TODOS LOS CASOS DEBE TENER ALTA
ACTIVIDAD ESPECIFICA
DETERMINACION DE ACTIVIDAD
ESPECIFICA: UNA VEZ MARCADO EL ADN SE
PRECIPIA CON TCA 5% Y SE CUENTA LA
MARCA PRECIPITADA
AE = TOTAL DE CUENTAS INCORPORADAS
MASA DE ACIDO NUCLEICO USADO
Marcación de SONDAS
NICK TRANSLATION
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
ACTUAN DOS ENZIMAS: DNasa 1 Y DNApolimerasa 1
SE UTILIZA ADN DOBLE CADENA
SE INTRODUCE NICK (AGUJERO) AL AZAR EN UNA
DE LAS CADENAS DEL ADN
SE USA ENZIMA CON ACTIVIDAD 5’-3’ EXONUCLEASA:
REMUEVE EL d NTP DEL EXTREMO 5’ (pol 1) Y EL
NICK SE VA TRASLADANDO
SE SEPARA EL MARCADO DEL RESTO POR
PRECIPITACION CON ETANOL O COLUMNA
SEPHADEX
Marcación de SONDAS
Marcación de SONDAS
RANDOM PRIMER
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
SE UTILIZA UNA SECUENCIA DE
OLIGONUCLEOTIDOS CONOCIDA O DE TIPO
HEXANUCLEOTIDOS (CUALQUIERA CONSENSO)
SE USA ADN SIMPLE CADENA (SE DESNATURALIZA
POR CALOR)
SE USA ENZIMA QUE NO POSEA ACTIVIDAD 5’ – 3’
EXONUCLEASA PARA QUE NO DEGRADE AL PRIMER
(Klenow)
SE GENERA CADENA COMPLEMENTARIA
SE SEPARA EL MARCADO DEL RESTO POR
PRECIPITACION CON ETANOL O COLUMNA
SEPHADEX
Marcación de SONDAS
Marcación de SONDAS
NICK
TRANSLATION
RANDOM PRIMER
MASA A MARCAR
50 – 500 ng
25 – 250 ng
ACTIVIDAD
ESPECIFICA
5 x 10 8 dpm/ug
1 X 10 9 dpm / ug
LARGO del
FRAGMENTO
MARCADO
200 – 500 d NTP
200 – 2000 d NTP
SONDA NO RADIOACTIVA:
SE USA 1 ug DE MASA A MARCAR
SENSIBILIDAD COMO RAD. CON AE = 1 x 10 8 dpm/ug
Marcación de SONDAS
MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS
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SE UTILIZAN PARA REALIZAR SCREENING DE
BIBLIOTECAS
SE MARCAN USANDO LA ENZIMA
DEOXINUCLEOTIDO TRANSFERASA (TdT) QUE
AGREGA d NTP AL EXTREMO 3’
TEMPLADO DE 20 a 30 NT
MASA A MARCAR: 20 ng
ACTIVIDAD ESPECIFICA: 5 x 10 6 dpm/ ug
SE OBTIENE BAJA SEÑAL QUE AYUDA A NO TENER
FONDO “SUCIO”
Marcación de SONDAS
Polymerase chain reaction (PCR)
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
Inventada en 1985 por Kary B. Mullis (Premio Nobel
de Química, 1993)
Se usa en criminología/medicina forense (identificar
personas a través de muestras de sangre, cabellos, por
comparación de DNA)
En el área de evolución (obtener enormes cantidades de
DNA a partir de fósiles que contienen trazas de DNA).
Revolucionó el diagnóstico de defectos genéticos,
(mutaciones), la detección de virus (HIV, HCV).
Permite hacer millones de copias de una muestra ínfima
de DNA.
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Si repetimos este ciclo (desnaturalización, annealing,
extensión) muchas veces logramos una amplificación
exponencial
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
EL PRODUCTO FORMADO A PARTIR DE LA PCR SE PUEDE LLAMAR
AMPLICON. ES ESPECIFICO Y SOLO DEBE VERSE UNA BANDA POR
AMPLIFICACION CON PRIMERS ESPECIFICOS.
Polymerase chain reaction (PCR)
CONCEPTOS BASICOS:

ESPECIFICIDAD: GENERACION DE UN UNICO PRODUCTO DE
AMPLIFICACION

EFICIENCIA: MAXIMA PRODUCCION DE AMPLIFICACION EN
FUNCION DEL NUMERO DE CICLOS

FIDELIDAD: NUMERO DE ERRORES QUE COMETE LA DNA
POLIMERASA DURANTE LA COPIA

SENSIBILIDAD: MINIMA CANTIDAD DE DNA QUE SE NECESITA
PARA OBTENER UNA GRAN CANTIDAD DE COPIAS
Polymerase chain reaction (PCR)
VARIANTES DE PCR:
NESTED PCR:
SE REALIZA UNA SEGUNDA REACCION DE PCR A PARTIR DEL
AMPLICON, USANDO PRIMERS INTERNOS A LA 1ª
AMPLIFICACION
AUMENTA LA SENSIBILIDAD : SE REALIZAN 2 REACCIONES
CONSECUTIVAS DE PCR
AUMENTA LA ESPECIFICIDAD: SE UTILIZAN OTROS PRIMERS
INTERNOS ESPECIFICOS

PCR MULTIPLEX:
UNA REACCIÓN DE PCR CON VARIOS PARES DE PRIMERS QUE
AMPLIFICAN DIFERENTES SECUENCIAS

Polymerase chain reaction (PCR)

DNA polimerasas para PCR :Termoestables
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
APLICACION
RUTINA
LONGITUD TEMPLADO
HASTA
5kb
ENZIMA
Taq Pol
ALTA ESPECIFICIDAD
Tº AMBIENTE
5kb
Platinum Taq Pol
ALTA ESPECIFICIDAD
ALTA FIDELIDAD
12kb
Platinum Pfu Pol
SIN AGREGADO DE A (PARA
GENOTIPIFICACION)
500pb
Platinum Genotype Pol
ALTO CONTENIDO DE GC
CODONES REPETIDOS
Dependiendo de la
polimerasa
Taq, Platinum Taq
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Cómo diseñamos los primers?
Tº MELTING
 MAYOR DE 20 nt:
Tm = 8105 + 16.6 log M + 0.41 (G-C) – 500/ longitud
 HASTA 20 nt:
Tm = 4 ∑ ( G + C) + 2 ∑ (A + T)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
RESUMEN

LONGITUD DE 18 a 24 d NTP
ESPECIFICOS
Tm = 55 a 75 C, CON Tm SIMILARES ENTRE SI
DISEÑAR PRIMERS CON CANTIDAD APROXIMADAMENTE 50% DE GC Y
DISTRIBUCION AL AZAR
EVITAR PRIMERS CON SECUENCIAS DE POLIPURINAS Y/O
POLIPIRIMIDINAS (Poly GC: DISMINUYE ESPECIFICIDAD - Poly AT:
DISMINUYE EFICIENCIA)
EVITAR SECUENCIAS QUE FORMEN ESTRUCTURAS SECUNDARIAS
CONTROLAR QUE LOS PRIMERS NO HIBRIDICEN ENTRE SI
EVITAR MAS DE 3 CG SEGUIDAD EN EL EXTREMO 3´
COMENZAR Y TERMINAR CON PURINAS

EXISTEN PROGRAMAS DNAstar PARA DISEÑO DE PRIMERS








Polymerase chain reaction (PCR)
PRIMERS DEGENERADOS:



SE USAN CUANDO QUIERO AMPLIFICAR UN
GEN Y SOLO CONOZCO SU SECUENCIA DE
AMINOACIDOS
SE REALIZAN TODOS LOS PRIMERS POSIBLES
PARA UNIRLOS A LA SECUENCIA DE INTERES
NO LOS DISEÑAMOS EN NUESTRO
LABORATORIO, SE PIDEN
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
PRIMERS DEGENERADOS:



SE USAN SECUENCIAS QUE ESTEN
CONSERVADAS PARA UNA FAMILIA DE
PROTEINAS
SE USA SECUENCIA CON MENOR
CANTIDAD DE CODONES POSIBLES
SE INCLUYEN SITIOS DE RESTRICCION
PARA CLONAR POSTERIORMENTE
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
PCR
1000000
100000
1000
100
10
Nº ciclos
60
50
40
25
1
0
Nº pb
10000
Polymerase chain reaction (PCR)
CONDICIONES PARA MEJORAR LA ESPECIFICIDAD
DISMINUIR:
 Mg++
 [d NTP]
 LARGO DE LOS CICLOS
 NUMERO DE CICLOS
 CONCENTRACION DE PRIMER
AUMENTAR:
 Tº DE ANNEALING
Polymerase chain reaction (PCR)
RESUMEN
MENOR TIEMPO Y MAYOR Tº DE ANNEALING:
MAYOR ESPECIFICIDAD
 CICLOS EXTRAS: MENOR ESPECIFICIDAD
PARA OBTENER MAS MASA DE AMPLIFICACION SE
REALIZA REAMPLIFICACION

CONTROL NEGATIVO:



SIN ADN
MUESTRA CON ADN QUE NO CONTIENE
SECUENCIA TARGET
SOLUCION DE EXTRACCION DE ADN
Polymerase chain reaction (PCR)
VARIANTES DE PCR PARA MEJORAR ESPECIFICIDAD:
HOT START PCR: EVITA PRODUCTOS INESPECIFICOS
GENERADOS INICIALMENTE CUANDO AUMENTA LA
Tº
SE REALIZA LA DESNATURALIZACIÓN DEL ADN Y AHÍ
SE AGREGA LA POLIMERASA


TOUCH DOWN PCR: Tº DE ANNEALING
DECRECIENTES PARA ASEGURAR MAXIMA
COMPLEMENTARIDAD DE LOS PRIMERS
Polymerase chain reaction (PCR)
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


APLICACIONES DE PCR
MUTAGENESIS
RT-PCR
PRODUCCION DE SONDAS
DETECCIÓN DE INFECCIONES BACTERIANAS Y
VIRALES
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS
ESTUDIOS DE EVOLUCIÓN MOLECULAR
ESTUDIOS DE MEDICIDNA FORENSE
ESTUDIOS DE FILIACIÓN
RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
RNAc DNA
RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
RNAc DNA
RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
RNAc DNA
RT-PCR Semi-cuantitativa



Control interno para normalizar: gen
constitutivo (eliminar errores en la
cantidad inicial de muestra)
PRIMERS: del gen de interés y del
control interno.
Cuantifico las bandas: relación
gen/control interno
C: células no tratadas.
 LPS: células expuestas a 100 µg/ml LPS
(E. colio, P. aeruginosa).
 ARP: acidic ribosomal phosphoprotein (control
interno para normalizar la cantidad de mRNA inicial).

Polymerase chain reaction (PCR)
PCR o RT-PCR CUANTITATIVA:
SE REALIZA UN CONTROL INTERNO QUE
SE UTILIZA PARA RELATIVIZAR LA
CANTIDAD DE AMPLICON OBTENIDA
DEL GEN DE INTERES
 SE REALIZA LA DETECCION DEL
CONTROL INTERNO Y DEL GEN DE
INTERES CON SONDAS ESPECIFICAS Y
DIFERENTES

Absorbancia
Polymerase chain reaction (PCR)
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
SEÑAL
CONTROL
SEÑAL
INTERES
0 15 20 25 30 35 40 45 50
No de ciclos
RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
RNAc DNA




RT -PCR
PRUEBA CUANTITATIVA PARA HIV
CARGA VIRAL = VIREMIA
HIV ES RETROVIRUS, SE OBTIENE RNA
Y SE REALIZA RT-PCR
SEGUIMIENTO DE LA TERAPIA DE
PACIENTE INFECTADO
LIMITE DE DETECCIÓN: 40 COPIAS
VIRALES/ML (ULTRASENSIBLE)
RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
RNAc DNA
RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
RNAc DNA
Rapid Amplification of cDNA Ends
RACE-PCR



RT-PCR para amplificar secuencias
desconocidas del extremo 3‘ y 5' del mRNA
Se realiza la RACE y se SECUENCIA el
producto obtenido
EVITA ERRORES DE LA PCR PUES
PRODUCTOS CORTOS
RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
RNAc DNA
RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
RNAc DNA
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Fluorocromo + Quencher (absorbe la energía del fluorocromo cuando
está cerca fluorocromo no fluoresce)
Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Aplicaciones de la PCR: PROTOCOLO DE AMPLIFICACION
DE LAS REPETICIONES TELOMERICAS QUE MIDE
ACTIVIDAD DE TELOMERASA

Polymerase chain reaction (PCR)

Aplicaciones de la PCR: deteminación de
polimorfismos genéticos