Transcript Técnicas de Estudio a Nivel Molecular

Técnicas de Estudio a Nivel
Molecular
DNA
- Southern Blot
-PCR
- FISH
- Secuenciación
RNA
-Northern Blot
-RT-PCR
-Microarray
Técnicas mas utilizadas para el
estudio de
DNA
Enzimas de restricción (endonucleasas)
De origen bacteriano.
Reconocimiento y corte de secuencias especificas (palindromicas) de 4 a 6 pb
Sistema de protección bacteriana.
Enzyme
AluI
Site
Enzyme
Site
AG'CT
NotI
GC'GGCCGC
BamHI
G'GATCC
PstI
CTGCA'G
BglII
A'GATCT
PvuII
CAG'CTG
EcoRI
G'AATTC
SalI
G'TCGAC
HaeIII
GG'CC
Sau3AI
HhaI
GCG'C
SmaI
CCC'GGG
HincII
GTY'RAC
SpeI
A'CTAGT
HindIII
A'AGCTT
TaqI
T'CGA
HinfI
G'ANTC
XbaI
T'CTAGA
HpaII
C'CGG
XhoI
C'TCGAG
KpnI
GGTAC'C
XmaI
C'CCGGG
MboI
'GATC
'GATC
Formación de extremos cohesivos
BamHI 5´--G‘ GATCC--3´
3´--CCTAG’ G--5´
---G´ 3´
---CCTAG 5´
5´ GATCC--3´ ’G---
Formación de extremos romos
HaeIII
---GG CC-----CC GG---
---GG
---CC
HincII
---GTC GAC-----CAG CTG---
---GTC
---CAG
CC--GG--GAC--CTG---
USOS
•Tecnología de DNA recombinante
Inserción en plásmidos
Creación de moléculas híbridas
•Mapas de restricción (caracterización de un gen)
•Análisis de mutaciones
•Creación de bibliotecas genómicas
•Preparación de la muestra para técnicas
posteriores (por ej. Southern Blot)
Southern Blot
Dos muestras A y B de simple cadena
Se blotearon sobre la membrana
Se Incuba con la sonda marcada
Solo la sonda complementaria se
“pega” a la secuencia correspondiente
Se revela por autoradiografía o
por quimioluminiscencia.
Gel de agarosa 0.7% con 14 muestras corridas
Tras la digestión con EcoRI.
Placa radiográfica revelando las cepas positivas
Para el gen de interés.
Polymerase Chain Reaction
 Desarrollada por Kary Mullis en 1983 en California y publicada por primera vez
en Science en 1985.
 Amplificación de fragmentos específicos de hasta 10.000 bp
 Ensayo de corta duración, de alta especificidad y reproducibilidad
 Pequeñas cantidades de DNA
 Se necesita conocer la secuencia o al menos la sec. flanqueante
Preparación
de la mezcla
Ciclos de
Temperatura
Análisis de
resultados
Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985).
Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site
analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-54
PCR
Termocicladores
modernos
Máquina de PCR
primitiva
Real Time PCR
Técnica utilizada para monitorear el progreso de una reacción de PCR a
medida que transcurre (tiempo real).
Pueden detectarse y cuantificarse cantidades mínimas de producto de PCR
(DNA, cDNA or RNA).
Está basado en la detección de fluorescencia producida por una molécula
reportera. Esto ocurre debido a la acumulación del producto de PCR en
cada ciclo de amplificación.
Estas moléculas fluorescentes pueden ser colorantes que se unen a la
doble hebra de DNA (ej. SYBR® Green ) o secuencias específicas (ej.
Molecular Beacons or TaqMan® Probes).
No es necesario pos procesamiento de la muestra.
Real time PCR es fácil de llevar a cabo, con alta sensibilidad y mayor
especificidad
También puede estudiarse expresión mediante el uso de RNA como molde
Secuenciación de DNA
Método de Sanger
FISH
Y un colado!!!!!
Detección de translocaciones
Estudios de cariotipo
Hibridación in situ para localización de expresión en
tejidos. a) embrión de pez b) nucleolo
Cromosomas marcados con sondas teloméricas
Técnicas mas utilizadas para
el estudio de
RNA
RT-PCR
Northern Blot
Y LO MAS NUEVO!!!!....
LO QUE ESTÁ DE MODA.....
Microarray