Transcript La hibridación permite la detección de secuencias específicas La hibridación de DNA, es la más común entre las técnicas basadas en.

La hibridación permite la detección de secuencias específicas
La hibridación de DNA, es la más común entre las técnicas basadas en la
secuencia para detectar un gen particular o un segmento de ácido nucleico.
Hay muchas versiones del método básico la mayoría usan un fragmento de DNA
o de RNA marcado (por ejemplo, con radiactividad), referido como sonda,
complementario del DNA buscado.
En un método clásico para detectar una secuencia de DNA concreta en una geno
teca, se presiona con un papel de nitrocelulosa contra una placa de agar con
muchas colonias bacterianas individuales, cada una de las cuales contiene un
fragmento de DNA recombinante distinto.
Algunas células de cada colonia se adhieren al papel, formando una réplica de la
placa.
El papel se trata con álcali para romper las células y desnaturalizar el DNA que
contienen, el cual permanece unido al papel alrededor de la región donde se
formó la colonia.
A continuación, se añade al papel la sonda de DNA marcada radiactivamente,
que se hibridará solamente con el DNA complementario.
Después de lavar la sonda sobrante, el DNA híbrido puede ser detectado por
autorradiografía (Fig. 1).
Fig. 1
Identificación de un clon con un determinado fragmento de DNA por
hibridación
La sonda de DNA radiactivo se hibrida con el DNA complementario y se revela por
autorradiografía. Una vez identificadas las colonias marcadas, se pueden usar las
correspondientes colonias de la placa de agar original como fuente de DNA
clonado para posteriores estudios.
Frecuentemente, el paso limitante en la detección o en la clonación de un gen
consiste en producir una cadena complementaria de ácido nucleico para usarla
como sonda.
El origen de la sonda depende de lo que se conozca del gen investigado. A veces,
puede usarse un gen homólogo, donado a partir de otra especie.
Si se ha purificado la proteína producto de un gen, se pueden diseñar y sintetizar
sondas a partir de la secuencia de aminoácidos y del conocimiento del código
genético (Fig. 2).
Cada vez se puede obtener más información sobre las secuencias de DNA en los
bancos de datos, que almacenan información sobre la estructura de miles de
genes de una gran variedad de organismos.
Fig. 2
Diseño de una sonda para detectar el gen de una proteína de secuencia
de aminoácidos conocida
Debido a que el código genético es degenerado, hay varias secuencias de DNA
que pueden codificar una secuencia de aminoácidos determinada.
Como no se puede conocer la secuencia de DNA correcta por adelantado, se
diseña la sonda para que sea complementaria de la zona de mínima degeneración
del gen (el menor número posible de codones).
Se sintetizan oligonucleótidos con secuencias selectivamente promediadas, de tal
manera que contengan uno de los dos posibles nucleótidos en cada posición de
potencial degeneración (sombreados en rojo).
En el ejemplo mostrado, el oligonucleótido sintetizado es, de hecho, una mezcla
de ocho secuencias diferentes: una de las ocho será totalmente complementaria
del gen, y todas ellas tendrán al menos 17 de las 20 posiciones complementarias.
Estos análisis han servido tanto para condenar como para absolver sospechosos
y para establecer la paternidad con un grado de confianza extraordinario.
El impacto de esta tecnología en los procedimientos judiciales continuará
creciendo, conforme se llegue a acuerdos sobre las condiciones para su uso y los
métodos se divulguen entre los laboratorios forenses.
Casos que han permanecido sin resolver, incluso durante décadas, pueden ser
investigados con estas técnicas: en 1996 se usó la huella del DNA para confirmar
la identificación de los huesos del último zar de Rusia y de su familia, asesinados
en 1918.
Aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante
Generalmente, la clonación de un gen es sólo el primer paso de un proyecto más
ambicioso, como puede ser la obtención de grandes cantidades de su proteína
producto.
Se puede cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína,introduciendo
cambios en los pares de bases del gen; esta estrategia puede ser muy útil en el
estudio del plegamiento, la estructura y la función de las proteínas.
El desarrollo de métodos cada vez más sofisticados para introducir y extraer DNA
de todo tipo de células está generando nuevos enfoques para el estudio de la
función y la regulación de los genes y para la incorporación de nuevos caracteres
en plantas y animales.
Ahora nos centraremos en las aplicaciones de la clonación del DNA, empezando
por las proteínas producidas por genes donados.
A continuación, describiremos los procedimientos de clonación utilizados en
diversas células eucarióticas, y acabaremos con una discusión de las
potencialidades e implicaciones de esta tecnología.
Los genes clonados se pueden expresar
Frecuentemente, más que en el gen en sí mismo, el interés reside en su
producto, sobre todo si la proteína tiene valor comercial, terapéutico o en la
investigación.
La comprensión de los fundamentos básicos del metabolismo del DNA, el RNA y
las proteínas y su regulación en E. coli, ha hecho posible la expresión de genes
clonados para estudiar sus productos proteicos.
La mayoría de genes eucarióticos carecen de las secuencias (promotores, etc.)
necesarias para su expresión en E. coli; las secuencias reguladoras bacterianas
para la transcripción y la traducción deben ser, pues, insertadas en el vector de
DNA, en posiciones apropiadas en relación con el gen eucariótico.
En algunos casos, los genes clonados se expresan tan eficazmente que el
producto proteico puede representar más del 10 % de la proteína celular.
Algunas proteínas foráneas pueden matar las células de E. coli cuando las
concentraciones son tan altas; en estos casos, se ha de limitar la expresión
génica a unas pocas horas antes de recoger las células.
Los vectores de clonación que contienen las señales de transcripción y
traducción necesarias para regular la expresión de un gen clonado se denomínan
frecuentemente vectores de expresión.
La velocidad de expresión del gen clonado se controla reemplazando las
secuencias reguladoras del propio promotor del gen por versiones más eficientes
y convenientes suministradas por el vector.
En general, para la clonación se coloca un promotor bien caracterizado con sus
elementos reguladores cerca de varios sitios de restricción únicos, de manera
que los genes insertados en los sitios de restricción se expresen bajo el control
de promotor (Fig. 3).
Fig. 3
Tipos de secuencias de DNA presentes en un vector de expresión en E. coli
Se inserta el gen que se desea expresar en uno de los sitios de restricción del
policonector, cerca del promotor, con el extremo que codifica el amino-terminal
orientado hacia el promotor.
El promotor posibilita una transcripción eficiente del gen insertado y la secuencia
de terminación de la transcripción puede en ocasiones mejorar la cantidad y la
estabilidad del mRNA producido.
El operador permite la regulación mediante un represor con el cual se une.
El sitio de unión al ribosoma contiene las señales necesarias para una traducción
eficiente del mRNA derivado del gen.
El marcador seleccionable permite la selección de las células que contienen el DNA
recombinante.
Algunos de estos vectores incorporan otras características, como sitios de unión al
ribosoma para mejorar la traducción del mRNA derivado del gen, y/o una secuencia
de terminación de la transcripción.
La sobre expresión de genes clonados en bacterias y otras células puede
suministrar grandes cantidades de proteínas importantes para la industria y para la
investigación.
Bibliografía
• Nelson David L, Cox Michael M. “ Lehninger Principios de Bioquímica”. Ediciones
Omega. 2001