Transcript Lab4_Precipitacion_Concentracionde_DNA

Precipitación y Concentración de
DNA
JA Cardé, PhD
Biol 4019 - Lab Biología Celular
Molecular
Universidad de Puerto Rico-Aguadilla
Objetivos
• Precipitar ácidos nucleicos que se encuentran
en solución.
• Utilizar correctamente un espectrofotómetro
para medir absorbancia a largos de onda de
260 nm y 280 nm.
• Determinar concentración y pureza de ácidos
nucleicos.
Introducción
• La técnica de precipitación etanólica tiene como fin:
• Remover residuos de cloroformo y/o fenol.
• Resuspender los ácidos nucleicos en pequeños
volúmenes de agua destilada o de TE pH 8.0 (Tris-HCL
y EDTA) permitiendo así concentrarlos.
• El DNA se puede precipitar de solución acuosa, a
temperaturas entre -20 ˚C y -70 ˚C, añadiendo una
concentración moderada de cationes monovalentes
(sales inorgánicas) y un volumen apropiado de etanol.
• El DNA se recobra a través de una centrifugación y se
resuspende en un pequeño volumen de un
amortiguador apropiado.
• Esta técnica es rápida y eficiente aun cuando se trabaja
con cantidades pequeñas de DNA.
Introducción …
• Luego de precipitar los ácidos nucleicos
utilizando etanol, es necesario remover todos
los residuos del mismo.
• La presencia de etanol en el DNA o
RNA interfiere con las reacciones enzimáticas
y/o las electroforesis con geles de agarosa.
• Además, los residuos de etanol dificultan el
proceso de resuspender los ácidos nucleicos en
solución.
Concentración y Pureza:
Espectrofotómetro
Son estimadas utilizando geles de agarosa, o
el espectrofotómetro.
• El espectrofotómetro es un instrumento que
estima la cantidad de luz que es absorbida por
la molécula en estudio (figura 1a).
• La muestra es colocada en una cuveta de
cuarzo o plástico.
• El rayo de luz de un largo de onda particular
pasa a través de la cuveta hasta un detector
(fototubo).
Concentración y Pureza:
Espectrofotometro
• El instrumento
automáticamente refleja la
lectura en absorbancia (o
densidad óptica, OD).
• El OD puede ser calculado
utilizando la siguiente fórmula:
• A = logIo/I
• Donde A = absorbancia, Io =
intensidad de la luz entrando a la
cuveta,
• I = intensidad de la luz que alcanza al
detector
Absorbancia
• Factores que podrían afectar la absorción de la luz de una
solución:
• concentración,
• solvente utilizado,
• la distancia que viaja el rayo de luz
• la característica de la cubeta.
• Para calcular la concentración de DNA o RNA en solución es
necesario leer la absorbancia de una dilución a un largo de onda
de 260 nm (OD260). Además, es necesario conocer la siguiente
información:
• 50 µg/ml de DNA de doble hebra refleja un O.D. de 1 a 260 nm
• 37 µg/ml de DNA de hebra sencilla refleja un O.D. de 1 a 260 nm
• 40 µg/ml de RNA de hebra sencilla refleja un O.D. de 1 a 260 nm
Concentración
•
La ecuación para determinar la concentración del DNA es:
Concentración de DNA (µg/ml) = (OD260) x (factor de dilución) x 50 µg de DNA/ml
1 Unidad de OD260
• Ejemplo:
• 10 µl de DNA se obtienen de una muestra de DNA con un volumen
total de 100 µl. Los 10 µl de DNA se añaden en la cuveta junto a 390
µl de agua. El OD260 obtenido es de 0.205.
• Concentración de DNA (µg/ml) = (0.205) x (400) x 50 µg de DNA/ml = 410 µg/ml
10
1 Unidad de OD260
• Para estimar la concentración TOTAL de DNA en la muestra
multiplique la concentración en µg/ml por el volumen de la
muestra.
•
410 µg x 0.09 ml* = 36.9 µg /ml
• * Comenzamos con 100 µl de la muestra - 10 µl utilizados para la
lectura de absorbancia = 90 µl; 90 µl / 1x106 ul/ml =
Pureza: Abs260/Abs280
• Además, es necesario estimar Abs a OD280.
• La razón entre la lecturas de OD260/ OD280 es utilizado
para estimar la pureza de los ácidos nucleicos.
• Una preparación pura de DNA debe tener un radio
OD260/ OD280 de 1.8 y el RNA un radio de 2.0.
• Un radio menor de 1.8 sugiere una extracción con fenol y
cloroformo para remover las proteínas que contaminan la
muestra de DNA. Y mayor de 1.8?
• Ejemplo:
• Si el OD260 de una muestra de DNA es de 0.205 y el
OD280 es de 0.114, el radio OD260/ OD280 será de 1.8.
¡Un DNA puro!
Materiales
Agua Destilada
Baño de Agua
Cuvetas Plasticas
Espectrofotómetro
Etanol 70%
Etanol 95%
Microcentrífuga
Micropipetas y puntas
Papel Kimwips
Vortex
Protocolo: Precipitación Etanólicas
• 1) Obtenga el microtubo que contiene el DNA con etanol al 95 %. Centrifugue
por 10 minutos a 12,000 rpm y descarte el sobrenadante.
•
• 2) Añada 300 µl de etanol al 70 % frío y mezcle utilizando el vortex.
•
• 3) Centrifugue por 5 minutos a 12,000 rpm y descarte el sobrenadante.
•
• 4) Invierta el microtubo con la tapa abierta sobre papel toalla. Déjelo reposar
por 5 minutos.
•
• 5) Incube el microtubo (tapa abierta) por 10 minutos a 65 ºC. Asegúrese de
remover todo el etanol.
•
• 6) Añada 50-200 µl de agua destilada previamente esterilizada. La cantidad de
agua va a depender del precipitado presente en el microtubo.
•
• 7) Incube el microtubo (tapa cerrada) por 5-30 minutos en un baño de María a
65 ºC. Asegúrese de que el DNA se encuentra resuspendido completamente
antes de proseguir.
•
Concentración y Pureza
• 1) Añada 1000 µl de agua destilada y previamente esterilizada a una
cuveta plástica para espectrofotómetro. Este será su blanco.
•
• 2) En otra cuveta de plástico, mezcle 10 µl de la solución de DNA
(paso A-7) y 990 µl de agua destilada previamente esterilizada.
•
• 3) Utilice el blanco para calibrar el espectrofotómetro.
•
• 4) Coloque la cuveta plástica del paso B-2 en el espectrofotómetro
y obtenga las lecturas de absorbancia a 260 nm y 280 nm.
•
• 5) Estime la concentración y pureza del DNA de su muestra.
•
• 6) Rotule correctamente su microtubo y guárdelo a – 20 ºC hasta
el próximo laboratorio.
•
•
Cálculos y Preguntas
Utilizando las fórmulas aprendidas en este módulo, estime la concentración y pureza
del DNA que se encuentra en solución.
• Preguntas
• ¿Cual es el rol del etanol en la precipitación de los ácidos nucleicos? Explique
su respuesta haciendo referencia a la estructura y enlaces de las
macromoléculas.
• Si el radio OD260/ OD280 de su muestra es menor de 1.8, su muestra de
DNA se encuentra contaminada con proteínas. ¿Qué ocurrió en el
procedimiento que afectó los resultados? ¿Qué debe hacer para mejorar
estos resultados?
• Como parte de su trabajo en un laboratorio, usted extrae DNA de un
organismo dado. Luego de precipitar el DNA usted debe estimar la
concentración del mismo. Cuando va a utilizar el espectrofotómetro se
percata de que esta dañado. ¿Cómo usted puede estimar la concentración y
pureza de su muestra de DNA? Explique el método utilizado y por qué lo
utiliza.
• ¿Puede el DNA ser precipitado utilizando isopropanol? De poder ser
utilizado, mencione las ventajas y desventajas que tiene el uso del mismo.
• 5El DNA puede ser resuspendido con agua destilada o TE. Mencione las
ventajas y desventajas de utilizar agua destilada versus TE y lo contrario.