Transcript Diapositiva 1

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Clonación de fragmentos de DNA
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Minipreps
Preparación de plásmido por lisis alcalina
Disolución P1
•Tris 50 mM pH 8.0
•EDTA 10 mM
+ RNasa 0.1 mg/ml
Disolución P2
•NaOH 0.2 N
•SDS 1%
Birnboin H.C., Doly J. (1979) A rapid
alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nucleic acids
research 7(6):1513-1522
Disolución P3
•Acetato potásico 3M
•Áciso acético 11%
Birnboin H.C., Doly J. (1979) A rapid
alkaline extraction procedure for the
isolation of plasmid DNA. Methods in
Enzymology 100:243-256
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Endonucleasas de restricción
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5
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Reacción catalizada por la DNA Ligasa
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Lehninger. Principios de Bioquímica
La defosforilación con fosfatasa alcalina
evita el religado del vector
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La Fosforilación con polinucleótido quinasa
facilita la ligación de fragmentos de DNA
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SÍNTESIS QUÍMICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Síntesis en fase sólida de una cadena de DNA por el método del triéster fosfito
(b-cianoetil)
(Dimetoxitritilo)
Finalmente se añade NH3 para eliminar los grupos protectores
y liberar el oligonucleótido del soporte sólido
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PUNTOS CLAVE DE UNA DNA POLIMERASA
• Fidelidad. La mantiene en dos etapas:
– Sólo forma enlace fosfodiéster si el nucleótido
correctamente empareado con el molde (error 10-4).
entrante está
– Si el emparejamiento ha sido incorrecto y aun así se ha formado enlace,
lo hidroliza con su actividad 3’ exonucleasa (error final 10-6)
• Eficiencia catalítica.
–
Depende fundamentalmente de la procesividad (1minuto asociaciónreasociación enzima-DNA; 1milisegundo adición de cada nucleótido)
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COMPARACIÓN DE LAS DNA POLIMERASAS
I, II Y III DE E. Coli
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Lehninger. Principios de Bioquímica
Secuenciación de DNA
Método de Sanger automatizado
5´--C T T A A
-
Oligo:
Molde: 3´--G A A T T C G C T A A T G C ---5´
- DNA polimerasa
- Nucleótidos
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
-Terminadores fluorescentes
ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP
Separación de los
fragmentos de DNA
marcados, mediante
electroforesis capilar
5´--C T T A A G -3´
5´--C T T A A G C -3´
5´--C T T A A G C G -3´
+
5´--C T T A A G C G A -3´
5´--C T T A A G C G A T -3´
5´--C T T A A G C G A T T -3´
láser
Detector de
fluorescencia
G C G A T T A C G . . .
5´--C T T A A G C G A T T A -3´
5´--C T T A A G C G A T T A C -3´
5´--C T T A A G C G A T T A C G -3´
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1 tggtcttcagATGTCTGATTCGCTAAATCA
150 accagaagtcTACAGACTAAGCGATTTAGT
31 TCCATCGAGTTCTACGGTGCATGCAGATGA
120 AGGTAGCTCAAGATGCCACGTACGTCTACT
61 TGGATTCGAGCCACCAACATCTCCGGAAGA
90 ACCTAAGCTCGGTGGTTGTAGAGGCCTTCT
91 CAACAACAAAAAACCGTCTTTAGAACAAAT
60 GTTGTTGTTTTTTGGCAGAAATCTTGTTTA
121 TAAACAGGAAAGAGAAGCGTTGTTTACGGg
30 ATTTGTCCTTTCTCTTCGCAACAAATGCCc
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Marcaje de sondas de DNA
“Random primer”
5´-CAATGGCGCCCGGTATTCGTAGTTTCTGGCACCGCATTTCGGA-3´
:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::
3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCGTAAAGCCT-5´
DNA polimerasa
dATP, dGTP, dTTP, 32P-dCTP
Oligonucleótidos aleatorios
5´-CAATGGCGCCCGGTATTCGTAGTTTCTGGCACCGCATTTCGGA-3´
3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCGTAAAGC-5´
5´-GCGCCC GGTATTCGTAGT 5´-TGGCACCGCATTTCGGA-3´
3´-GTTACCGCGGGCCATAAGCATCAAAGACCGTGGCGTAAAGCCT-5´
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Sistemas de expresión bacterianos
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Sistemas de expresión bacterianos
basados en la RNA polimerasa de T7
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Sistemas de expresión bacterianos:
precipitación de proteínas recombinantes
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Sistemas de expresión bacterianos:
“refolding” de proteínas recombinantes
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Utilización de transcriptasa reversa para
obtener cDNA
I
DNA
II III IV
V VI VII
VIII
exones
Transcripción
Pre- mRNA
Maduración
mRNA maduro
AAAA
Transcripción reversa
cDNA
TTTT
AAAA
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MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
• Eliminación en la mayoría de los
casos de la formilmetionina en
procariotas y de la metionina
iniciadora en eucariotas en el
extremo N-t.
• Fosforilación de ciertos residuos
de Ser, Thr y Tyr en algunas
proteínas.
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MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
• Unión de grupos lipídicos (isoprenilación, palmitoilación,
miristoilación)
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MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
• Glicosilación (adición de glúcidos) de residuos de Asn
mediante enlaces N-glicosídicos o de residuos de Ser o Thr
mediante enlaces O-glicosídicos.
• Formación de puentes disulfuro.
• Modificación proteolítica. Algunas proteínas, como la
insulina, la tripsina, la quimotripsina, se sintetizan como
precursores inactivos, y han de ser procesadas
proteolíticamente para dar sus formas activas, más
pequeñas.
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Envío de proteínas al Retículo Endoplásmico
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Sistemas de expresión en células animales
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Introducción de DNA en células animales
• Carácter transitorio.
El DNA sólo es introducido en parte de las
células del cultivo. No se aplica selección. El cultivo se recoge y analiza
al cabo de unos pocos días.
• Carácter estable.
El vector debe contener un marcador (p.ej. un
gen de resistencia a un antibiótico) que permita seleccionar las células
en las que se ha introducido el DNA e integrado en el genoma. Se
pueden aislar clones individuales o trabajar con toda la población.
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Introducción de DNA en células animales
• Transfección.
• Polímeros catiónicos (DEAE-Dextrano, Polietilenimina (PEI)
• Fosfato cálcico
• Lípidos catiónicos
• Transducción.
• Partículas virales. Retrovirus
• Microinyección
• Electroporación.
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Introducción de DNA en células animales
• Transfección.
• Polímeros catiónicos (DEAE-Dextrano, Polietilenimina (PEI), FuGENE
• Fosfato cálcico
• Lípidos catiónicos (Lipofectamina)
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Introducción de DNA en células animales
• Electroporación.
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Introducción de DNA en células animales
• Transfección transitoria: éxito parcial
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Introducción de DNA en células animales
• Transducción
Célula
empaquetadora
Célula
diana
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Introducción de DNA en células animales
• Transducción
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Sistemas de expresión inducibles
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Transgénicos inducibles
collagen II
tTA
doxicyclin
TRE
Collagenase 3
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Transgénicos inducibles
collagen II
tTA
doxicyclin
TRE
Collagenase-3
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